CD31의 발현을 억제하기 위한 수단(Means for inhibiting the expression of CD31)

(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(11) 공개번호 10-2009-0004984
(43) 공개일자 2009년01월12일
(51) Int. Cl.

C12N 15/11 (2006.01) C12N 15/09 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2008-7025259
(22) 출원일자 2008년10월16일
심사청구일자 없음
번역문제출일자 2008년10월16일
(86) 국제출원번호 PCT/EP2007/003495
국제출원일자 2007년04월20일
(87) 국제공개번호 WO 2007/121946
국제공개일자 2007년11월01일
(30) 우선권주장
06008208.8 2006년04월20일
유럽특허청(EPO)(EP)
(71) 출원인
사일런스 테라퓨틱스 아게
독일 디-13125 베를린 로베르트-뢰쓸레-스트라쎄
10
(72) 발명자
카우프맨, 조르그
독일 베를린 13437 스피에쓰웨그 68
케일 올리버
독일 글리니케 16548 바살드헤크 2체
산텔, 안스갈
독일 베를린 10779 베르히테스가드너 스트라쎄 8
(74) 대리인
김해중, 윤석운, 홍순우
전체 청구항 수 : 총 33 항
(54) ＣＤ31의 발현을 억제하기 위한 수단
(57) 요 약
본 발명은 이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하고, 제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포
함하고 제1 스트레치가 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며, 제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오
타이드를 포함하고 제2 스트레치가 적어도 부분적으로 제1 스트레치에 상보적이며, 제1 스트레치가 서열번호 1에
따른 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열을 포함하고, 뉴클레오타이드 코
어 서열이 서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 1277번 내지 1295번; 서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2140번 내
지 2158번 및 서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2391번 내지 2409번으로부터의 뉴클레오타이드 서열을
포함하고, 제1 스트레치가 추가로 뉴클레오타이드 코어 서열의 5'말단 선행 영역 및/또는 뉴클레오타이드 코어
서열의 3' 말단 후행 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 이본쇄 구조를 포함하는 핵산 분자에 관한 것이다
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공개특허 10-2009-0004984
특허청구의 범위
청구항 1
이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하고,
제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제1 스트레치가 적어도 부분적으로 표적 핵산에
상보적이며,
제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제2 스트레치가 적어도 부분적으로 제1 스트레치
에 상보적이며,
제1 스트레치가 서열번호 1에 따른 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열
을 포함하고,
뉴클레오타이드 코어 서열이,
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 1277번 내지 1295번;
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2140번 내지 2158번 및
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2391번 내지 2409번
으로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,
제1 스트레치가 추가로 뉴클레오타이드 코어 서열의 5'말단 이전 영역 및/또는 뉴클레오타이드 코어 서열의 3'
이후 영역에 적어도 부분적으로 상보적인,
이본쇄 구조를 포함하는 핵산 분자.
청구항 2
제1항에 있어서, 제1 스트레치가 뉴클레오타이드 코어 서열에 상보적인 핵산.
청구항 3
제1항 또는 제2항에 있어서, 제1 스트레치가 추가로 뉴클레오타이드 코어 서열의 3' 말단 이후 영역에 상보적인
핵산.
청구항 4
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 스트레치가 18개 내지 29개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 19개
내지 25개 뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 19개 내지 23개 뉴클레오타이드에 대해 표적 핵산과 상보적인
핵산.
청구항 5
제4항에 있어서, 뉴클레오타이드가 연속선상의 뉴클레오타이드인 핵산.
청구항 6
제1항에 있어서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치가 18개 내지 29개의 연속선상의 뉴클레오타이드, 바람직하
게는 19개 내지 25개의 연속선상의 뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 19개 내지 23개의 연속선상의 뉴클레
오타이드를 포함하는 핵산.
청구항 7
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 쇄가 제1 스트레치로 이루어지고/지거나 제2 쇄가 제2 스트레치
로 이루어진 핵산.
청구항 8
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
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공개특허 10-2009-0004984
이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄에 의해 형성되고,
제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드이고 제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드이며
제1 스트레치가 제2 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적이며, 제1 스트레치가 서열번호 2에 따른 뉴클레오타
이드 서열로 이루어지고 제2 스트레치가 서열번호 3에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며;
제1 스트레치가 서열번호 4에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 5에 따른 뉴클
레오타이드 서열로 이루어지며;
제1 스트레치가 서열번호 6에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 7에 따른 뉴클
레오타이드 서열로 이루어지며;
제1 스트레치가 서열번호 8에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 9에 따른 뉴클
레오타이드 서열로 이루어지는
이본쇄 구조를 포함하는 핵산 분자.
청구항 9
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/또는 제2 스트레치가 2' 위치에서 변형되어 스트레치내에서
변형된 뉴클레오타이드의 각 그룹이 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹에 의해 한쪽 측쇄 및 양쪽 측쇄상에서 플랭킹
되고 뉴클레오타이드의 플랭킹 그룹을 형성하는 플랭킹 그룹이 변형되지 않은 뉴클레오타이드이거나 변형된 뉴
클레오타이드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오타이드이며 바람직하게 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레
치 각각이 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 2개 이상의 그룹 및 뉴클레오타이드의 2개 이상의 플랭킹 그룹을 포
함하는, 변형된 뉴클레오타이드의 다수 그룹을 포함하는 핵산 분자.
청구항 10
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치가 변형된 뉴클레오타이드 그룹
패턴 및/또는 뉴클레오타이드의 플랭킹 그룹 패턴을 포함하고, 이때, 당해 패턴이 위치적 패턴인 핵산.
청구항 11
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제1항 내지 제8항 어느 한 항에 있어서, 제1 스트레
치 및/또는 제2 스트레치가 3' 말단에서 디뉴클레오타이드를 포함하고, 이때, 당해 디뉴클레오타이드는 바람직
하게 TT인 핵산.
청구항 12
제11항에 있어서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치의 길이가 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드, 바람직하게
는 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드로 이루어진 핵산.
청구항 13
제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 및/
또는 제2 스트레치가 3' 말단에 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함하는 핵산.
청구항 14
제13항에 있어서, 이본쇄 구조의 길이가 약 16 내지 24개 뉴클레오타이드 쌍, 바람직하게는 20개 내지 22개의
뉴클레오타이드 쌍인 핵산.
청구항 15
제1항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서, 제1 쇄 및 제2 쇄가 서로 공유적으로 연결되고, 바람직하게는 제1
쇄의 3' 말단이 제2 쇄의 5' 말단에 공유적으로 연결된 핵산.
청구항 16
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산 및 리포좀을 포함하는 지질복합체.
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청구항 17
제16항에 있어서, 리포좀이,
a) 약 50 몰%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드, 바람
직하게는 (β-(L-아르기닐)-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드);
b) 약 48 내지 49 몰%의 l,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE); 및
c) 약 1 내지 2 몰%의 l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민- 폴리에틸렌-글리콜, 바람직하게는 N-
(카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜- 2000)-l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염
으로 이루어진 지질복합체.
청구항 18
제17항에 있어서, 지질복합체의 제타-전위가 40 내지 55 mV, 바람직하게는 약 45 내지 50 mV인 지질복합체.
청구항 19
제17항 또는 제18항에 있어서, 크기가 QELS 측정시 약 80 내지 200 nm, 바람직하게는 약 100 내지 140 nm, 및
보다 바람직하게는 약 110nm 내지 130 nm인 지질복합체.
청구항 20
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하거나 이를 암호화하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터.
청구항 21
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 따른 핵산 또는 제1항 내지 제20항중 어느 한 항에 따른 벡터를 포함하는
세포로서, 세포가 사람 세포인 경우, 사람 세포가 분리된 세포인 세포.
청구항 22
제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따른 지질복합체, 제20항
에 따른 벡터 및/또는 제21항에 따른 세포를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물.
청구항 23
제22항에 있어서, 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 약제학적 조성물인 조성물.
청구항 24
제23항에 있어서, 조성물이 약제학적 조성물이고 약제학적 조성물이 혈관형성 의존성 질환, 바람직하게는 불충
분하거나 비정상적이거나 과도한 혈관형성을 특징으로 하는 질환을 치료하기 위한 것인 조성물.
청구항 25
제24항에 있어서, 혈관형성이 지방 조직, 피부, 심장, 눈, 폐, 장, 생식가관, 골 및 관절의 혈관형성인 약제학
적 조성물.
청구항 26
제24항 또는 제25항에 있어서, 질환이, 감염성 질환, 자가면역 장애, 혈관기형, 죽상동맥경화증, 이식
동맥병증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 지속성 과증식성 유리체 증후군, 당뇨 망막병증, 미성숙 망
막병증, 노인성 황반 질환, 맥락막 신생혈관, 원발성 폐성 고혈압, 천식, 비폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복
수, 복막 접착, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소낭, 난소, 난소 과자극, 관절염, 활막염, 골수염 및 골극형성을 포
함하는 그룹으로부터 선택되는 약제학적 조성물.
청구항 27
제23항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제23항에 있어서, 신생물 질환, 바람직하게는 암 질
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환 및 보다 바람직하게는 고형 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
청구항 28
제23항 내지 제26항중 어느 한 항에 있어서, 바람직하게는 제27항에 있어서, 골암, 유방암, 전립선암,
소화기암, 결장직장암, 간암, 폐암, 신장암, 비뇨기암, 췌장암, 뇌하수체암, 고환암, 안와암, 두경부암, 중추
신경계암 및 호흡기암을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
청구항 29
약물을 제조하기 위한, 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제16항 내지 제19항 중 어느 한 항에 따
른 지질복합체, 제20항에 따른 벡터 및/또는 제21항에 따른 세포의 용도.
청구항 30
제29항에 있어서, 약물이 제24항 내지 제28항 중 어느 한 항에 정의된 바와 같은 질환중 어느 하나를 치료하기
위한 것인 용도.
청구항 31
제30항에 있어서, 약물이 하나 이상의 기타 치료제와 병용하여 사용되는 용도.
청구항 32
제31항에 있어서, 치료가 화학치료, 냉동요법, 발열요법, 항체 치료 및 방사능 치료를 포함하는 그룹으로부터
선택되는 용도.
청구항 33
제32항에 있어서, 치료가 항체 치료이고 보다 바람직하게는 항-VEGF 항체를 사용한 항체 치료인 용도.
명 세 서
본 발명은 CD31의 발현을 억제하는데 적합한 이본쇄 핵산 및 이의 용도에 관한 것이다.<1>
발암과정은 다단계 생물학적 과정으로서 포울드(1958)에 의해 보고되었고 현재 유전자 손상이 축적되어 유발되<2>
는 것으로서 공지되어 있다. 분자 수준에서, 종양 형성의 다단계 과정은 양성 및 음성 조절 이펙터(effector)
둘다가 붕괴되는 것을 포함한다(문헌참조: Weinberg, 1989). 보겔슈타인 및 이의 동료(Vogelstein and
coworker)(1990)는 사람 결장 암종에 대한 분자적 근거에서 다수의 발암 유전자, 종양 서프레서 유전자 및 복구
유전자가 관여하는 것으로 주장하였다. 유사하게, 망막모세포종의 발병을 유발하는 결함은 또 다른 종양 서프
레서 유전자와 연계되어 있다(Lee et al., 1987). 여전히, 또 다른 발암유전자 및 종양 서프레서가 다양한 기타
악성종양에서 동정되었다. 불행하게도, 아직 치료가능한 암의 수는 충분하지 않고 암의 효과는 미국에서만 연간
50만명 이상이 사망할 정도로 엄청난 재앙이다.
암은 기본적으로 세포 DNA에 대한 손상이 세포 증식을 조절하는 정상적인 기작을 붕괴시키는 유전학적<3>
질환이다. 종양 서프레서가 게놈의 위상을 유지하는 2개의 작용 기작은 세포증식을 억제하여 손상된 DNA를 복
구하거나 어팝토시스(apoptosis)에 의해 손상된 DNA를 제거하는 것이다(문헌참조: Ellisen and Haber, 1998;
Evan and Littlewood, 1998). "프로그램화된 세포 사멸"이라고도 호칭되는 어팝토시스는 복구불가능한 손상된
세포를 겨냥한 세포 자살 프로그램으로서 작용하는, 세심하게 조절되는 생화학적 반응 네트워크이다. 어팝토시
스는 종양 괴사 인자의 결합, DNA 손상, 성장 인자의 퇴거 및 Fas 수용체의 항체 가교 결합을 포함하는, 다수의
방식으로 유발될 수 있다. 어팝토시스 과정에 역할을 수행하는 다수의 유전자들이 동정되었지만 어팝토시스를
유도하는 경로는 완전하게 해명되지 못하였다. 많은 연구자들은 신규 어팝토시스 촉진 유전자가 신생물성 세포
에서 선택적으로 어팝토시스를 유도하여 환자에서 암을 치료하기 위한 수단을 제공할 것이라는 의도에서 당해
신규 아폽토시스 촉진 유전자를 동정하고자 하였다.
암을 치료하기 위한 또 다른 방법은 엔도스타틴(Endostatin
TM
) 또는 항-VEGE 항체와 같은 제제를 사용한 혈관형<4>
성의 억제를 포함한다. 당해 방법에서의 목적은 1차 종양의 추가의 혈관형성을 차단하고 잠재적으로 실질적인
혈관 형성 없이 신생물성 세포 생존을 지지할 수 있는 전이성 병변의 크기를 억제하기 위한 것이다.
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공개특허 10-2009-0004984
혈소판 내피 세포 접착 분자(CD31 또는 PECAM-1로서도 언급됨)는 내피 세포 및 호중구상에서 발견되는 단백질이<5>
고 내피층을 통과하는 백혈구의 이동에 관여하는 것으로 밝혀졌다. 혈전증, 혈관 폐색 및 졸중과 같은 심혈관
증상의 치료 및 혈류 폐쇄 질환을 감소시키거나 이를 위한 치료 및 지혈 장애의 발생을 감소시키거나 이에 대한
치료를 위해 CD-31의 활성을 조절하는 것은 문헌[참조: WO 03055516Al에 기재되어 있다. PECAM-1는 또한 염증
과정에 연루되어 있고 항-PECAM-1 모노클로날 항체는 생체내에서 호중구 동원을 차단하는 것으로 보고되었다(문
헌참조: Nakada et al. (2000) J. Immunol. 164: 452 - 462). CD31 녹아웃(knockout) 마우스가 보고되었고 백
혈구 이동, 혈소판 응집 및 혈관 발육이 정상인 것으로 나타나 이는 CD31의 결핍을 보충할 수 있는 잉여의 접착
분자가 있음을 암시한다(문헌참조: Duncan et al. (1999) J. Immuonol. 162: 3022-3030). CD31에 대한 모노클
로날 항체는 종양 이식 모델[문헌참조: (Zhou et al. (1999) Angiogenesis 3: 181-188)] 및 사람 피부 이식
모델(문헌참조: Cao et al. (2002) Am. J. Physiol. Cell Physiol. 282: Jl 181-Cl 190) (Zhou et al. (1999)
Angiogenesis 3: 181-188)에서 쥐 내피 관(tube) 형성 및 관련 혈관형성의 증상을 차단하는 것으로 보고되었다.
그러나, 종양 혈관형성에서 PECAM-1의 역할은 아직 규명되지 않았다.
지금까지 항-혈관형성 전략을 사용한 암 및 종양 전이의 억제에 대한 노력이 상당히 시도되었지만 혈관형성 억<6>
제만으로 암을 치료하기 위해 승인되고 시판되는 약물은 없다. 실질적으로, CD31을 포함하는 다양한 접착 분자
의 신생물 및 전이 과정에서의 구체적인 역할이 공지되어 있지 않다.
이러한 측면에서, 당업계에서는 신생물 질환을 치료하기 위한 수단이 계속적으로 요구되고 있다. 보다 구체적으<7>
로는, 상당한 수의 신생물성 질환에 기본적인 기작 측면에서, 혈관형성, 보다 특히, 신생물성 질환에 기본적인
병리학적 기작에 관여하는 혈관형성에 영향을 미치는데 적합한 수단이 요구되고 있다.
본 발명에 기본적인 문제점은 제1 측면에서,<8>
이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하고, 제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고<9>
당해 제1 스트레치가 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이며,
제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제2 스트레치가 적어도 부분적으로 제1 스트레치<10>
에 상보적이며,
표적 핵산이 CD31을 암호화하는 mRNA인 이본쇄 핵산 분자에 의해 해결되었다.<11>
바람직한 양태에서, 핵산은 리보핵산이다.<12>
본 발명에 기본적인 문제점은 제2 측면에서,<13>
이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함하고,<14>
제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제1 스트레치가 적어도 부분적으로 표적 핵산에<15>
상보적이며,
제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제2 스트레치가 적어도 부분적으로 제1 스트레치<16>
에 상보적이며,
제1 스트레치가 서열번호 1에 따른 핵산 서열의 뉴클레오타이드 서열에 적어도 부분적으로 상보적인 핵산 서열<17>
을 포함하고,
뉴클레오타이드 코어 서열이<18>
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 1277번 내지 1295번;<19>
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2140번 내지 2158번 및 <20>
서열번호 1의 뉴클레오타이드 위치 2391번 내지 2409번<21>
으로부터의 뉴클레오타이드 서열을 포함하고,<22>
제1 스트레치가 추가로 뉴클레오타이드 코어 서열의 5'말단 선행 영역 및/또는 뉴클레오타이드 코어 서열의 3'<23>
말단 후행 영역에 적어도 부분적으로 상보적인 이본쇄 구조를 포함하는 핵산 분자에 의해 해결된다.
제2 측면의 양태에서, 제1 스트레치는 뉴클레오타이드 코어 서열에 상보적이다.<24>
제1 및 제2 측면의 양태에서, 제1 스트레치는 추가로 뉴클레오타이드 코어 서열의 3'말단의 후행 영역에 상보적<25>
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공개특허 10-2009-0004984
이다.
제1 및 제2 측면의 양태에서, 제1 스트레치는 18개 내지 29개 뉴클레오타이드, 바람직하게는 19개 내지 25개 뉴<26>
클레오타이드 및 보다 바람직하게는 19개 내지 23개의 뉴클레오타이드에 대해 표적 핵산과 상보적이다.
제1 및 제2 측면의 바람직한 양태에서, 뉴클레오타이드는 연속 뉴클레오타이드이다.<27>
제1 측면의 양태에서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 18개 내지 29개의 연속 뉴클레오타이드, 바람직하<28>
게는 19개 내지 25개의 뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 19개 내지 23개의 연속 뉴클레오타이드를 포함한
다.
제1 및 제2 측면 양태에서, 제1 쇄는 제1 스트레치로 이루어진고/지거나 제2 쇄는 제2 스트레치로 이루어진다.<29>
본 발명의 기본적인 문제점은 또한 제3 측면에서, <30>
이본쇄 구조가 제1 쇄 및 제2 쇄에 의해 형성되고,<31>
제1 쇄가 제1 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드이고 제2 쇄가 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드이며<32>
제1 스트레치가 제2 스트레치에 적어도 부분적으로 상보적이며,
제1 스트레치가 서열번호 2에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고;<33>
제2 스트레치가 서열번호 3에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지며;<34>
제1 스트레치가 서열번호 4에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 5에 따른 뉴클<35>
레오타이드 서열로 이루어지며;
제1 스트레치가 서열번호 6에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 7에 따른 뉴클<36>
레오타이드 서열로 이루어지며;
제1 스트레치가 서열번호 8에 따른 뉴클레오타이드 서열로 이루어지고, 제2 스트레치가 서열번호 9에 따른 뉴클<37>
레오타이드 서열로 이루어지는 이본쇄 구조를 포함하는
핵산 분자, 바람직하게는 제1 및 제2 측면에 따른 핵산 분자에 의해 해결된다.<38>
제1, 제2 및 제3 측면의 양태에서, 제1 및/또는 제2 스트레치는 2' 위치에서 변형되어 스트레치내에서 변형된<39>
뉴클레오타이드의 각 그룹이 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹에 의해 한쪽 측쇄 및 양쪽 측쇄상에서 플랭킹되고 뉴
클레오타이드의 플랭킹 그룹을 형성하는 플랭킹 그룹이 변형되지 않은 뉴클레오타이드이거나 변형된 뉴클레오타
이드의 변형과는 상이한 변형을 갖는 뉴클레오타이드이며 바람직하게 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치 각각
이 변형된 뉴클레오타이드의 적어도 2개 이상의 그룹 및 뉴클레오타이드의 2개 이상의 플랭킹 그룹을 포함하는,
변형된 뉴클레오타이드의 다수 그룹을 포함한다.
제1, 제2 및 제3 측면의 양태에서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치가 변형된 뉴클레오타이드 그룹 패턴 및/<40>
또는 뉴클레오타이드의 플랭킹 그룹 패턴을 포함하고, 이때, 당해 패턴은 바람직하게 위치적 패턴이다.
제1, 제2 및 제3 측면의 양태에서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치가 3' 말단에서 디뉴클레오타이드를 포함<41>
하고, 이때, 당해 디뉴클레오타이드는 바람직하게 TT이다.
제1 및 제2 및 제3 측면의 바람직한 양태에서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치의 길이는 19개 내지 23개의<42>
뉴클레오타이드, 바람직하게는 19개 내지 21개의 뉴클레오타이드로 이루어진다.
제1, 제2 및 제3 측면의 양태에서, 제1 및/또는 제2 스트레치는 3' 말단에 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 오버<43>
행을 포함한다.
제1, 제2 및 제3 측면의 바람직한 양태에서, 이본쇄 구조의 길이는 약 16 내지 24개 뉴클레오타이드 쌍이고, 바<44>
람직하게는 20개 내지 22개 뉴클레오타이드 쌍이다.
제3 측면의 양태에서, 제1 쇄 및 제2 쇄는 서로 공유적으로 연결되어 있고, 바람직하게는 제1 쇄의 3' 말단이<45>
제2 쇄의 5' 말단에 공유적으로 연결되어 있다.
본 발명에 기본적인 문제점은 또한 제4 측면에서, 제1, 제2 및 제3 측면에 따른 핵산 및 리포좀을 포함하는 지<46>
질복합체에 의해 해결된다.
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제4 측면의 양태에서, 리포좀은,<47>
a) 약 50 몰%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드, 바람<48>
직하게는 (β-(L-아르기닐)-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드);
b) 약 48 내지 49 몰%의 l,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE); 및 <49>
c) 약 1 내지 2 몰%의 l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민- 폴리에틸렌-글리콜, 바람직하게는 N-<50>
(카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜- 2000)-l,2-디스테아로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염으로 이루
어진다.
제4 측면의 바람직한 양태에서, 지질복합체의 제타 전위는 약 50 내지 55mV이고 바람직하게는 약 45 내지 50mV<51>
이다.
제4 측면의 양태에서, 지질복합체는 QELS로 측정시 약 80 내지 200nm, 바람직하게는 약 100 내지 140nm 및 보다<52>
바람직하게는 약 110nm 내지 130nm의 크기를 갖는다.
본 발명에 기본적인 문제점은 또한 제5 측면에서, 제1, 제2 및 제3 측면에 따른 핵산을 포함하거나 이를 암호화<53>
하는 벡터, 바람직하게는 발현 벡터에 의해 해결된다.
본 발명에 기본적인 문제점은 또한 제6 측면에서 이전의 측면중 어느 하나에 따른 핵산 또는 제5 측면에 따른<54>
벡터를 포함하는 세포에 의해 해결된다.
본 발명에 기본적인 문제점은 또한 제7 측면에서 제1, 제2 및 제3 측면에 따른 핵산, 제4 측면에 따른 지질복합<55>
체, 제5 측면에 따른 벡터 및/또는 제6 측면에 따른 세포를 포함하는 조성물, 바람직하게는 약제학적 조성물에
의해 해결된다.
제7 측면의 양태에서, 당해 조성물은 임의로 약제학적으로 허용되는 비히클을 추가로 포함하는 약제학적 조성물<56>
이다.
제7 측면의 바람직한 양태에서, 당해 조성물은 약제학적 조성물이고 당해 약제학적 조성물은 혈관형성 의존성<57>
질환, 바람직하게는 불충분하거나 비정상적이거나 과도한 혈관형성을 특징으로 하거나 이에 의해 발병되는 질환
을 치료하기 위한 것이다.
제7 측면의 보다 바람직한 양태에서, 당해 혈관형성은 지방조직, 피부, 심장, 눈, 폐, 장, 생식기관, 골 및 관<58>
절의 혈관형성이다.
제7 측면의 양태에서, 당해 질환은 감염성 질환, 자가면역 장애, 혈관 기형, 죽상동맥경화증, 이식 동맥병증,<59>
비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 지속성 과증식성 유리체 증후군, 당뇨 망막병증, 미성숙 망막병증,
노인성 황반 질환, 맥락막 신생혈관, 원발성 폐성 고혈압, 천식, 비폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막
접착, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소낭, 난소, 난소 과자극, 관절염, 활막염, 골수염 및 골극형성을 포함하는 그
룹으로부터 선택된다.
제7 측면의 양태에서, 당해 약제학적 조성물은 신생물성 질환, 바람직하게는 암 질환 및 보다 바람직하게는 고<60>
형 종양을 치료하기 위한 것이다.
제7 측면의 양태에서, 약제학적 조성물은 골암, 유방암, 전립선암, 소화기암, 결장직장암, 간암, 폐암, 신장암,<61>
비뇨기암, 췌장암, 뇌하수체암, 고환암, 안와암, 두경부암, 중추신경계암 및 호흡기암을 포함하는 그룹으로부터
선택되는 질환을 치료하기 위한 것이다.
본 발명에 기본적인 문제점은 또한 제8 측면에서, 약물을 제조하기 위해 제1 , 제2 및 제3 측면에 따른 핵산의<62>
사용, 제4 측면에 따른 지질복합체의 사용, 제5 측면에 따른 벡터의 사용 및/또는 제6 측면에 따른 세포의 사용
에 의해 해결된다.
제8 측면의 양태에서, 당해 약물은 본 발명에 따른 약제학적 조성물의 다양한 양태와 관련되어 정의된 바와 같<63>
은 임의의 질환을 치료하기 위한 것이다.
제8 측면의 바람직한 양태에서, 당해 약물은 하나 또는 여러 다른 치료법, 바람직하게는 항종양 또는 항암치료<64>
와 병용하여 사용된다.
제8 측면의 보다 바람직한 양태에서, 당해 치료는 화학요법, 냉동요법, 온열요법, 항체치료 및 방사선 치료를<65>
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포함하는 그룹으로부터 선택된다.
제8 측면의 보다 더 바람직한 양태에서, 당해 치료는 항체 치료 및 보다 바람직하게는 항-VEGF 항체를 사용한<66>
항체 치료이다.
본 발명의 다양한 측면의 추가로 바람직한 양태에서, mRNA는 CD31의 사람 mRNA이다. 보다 더 바람직한 양태에<67>
서, 표적 핵산은 서열번호 1에 따른 핵산 서열을 갖는 mRNA이다. 다양한 개체 또는 개체 그룹, 바람직하게는
집단에서 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 mRNA와 비교하여 mRNA에 하나 또는 여러 단일 뉴클레오타이
드 변화가 있을 수 있음은 당업자가 인지할 것이다. 서열번호 1의 핵산 서열을 갖는 mRNA와 비교하여 하나 또는
여러 단일 뉴클레오타이드 변화를 갖는 당해 mRNA는 또한 본원에서 바람직하게 사용되는 바와 같은 용어 표적
핵산에 포함될 것이다. 여전히 추가의 양태에서, 본 발명의 다양한 측면에 따른 핵산 분자는 CD31 및 이를 암
호화하는 mRNA의 발현을 억제하는데 적합하다. 보다 바람직하게, 당해 발현은 RNA 간섭 또는 전사후 유전자 사
일런싱으로 언급되는 기작에 의해 억제된다. 따라서, 본 발명에 따른 siRNA 분자 및 RNAi 분자 각각은 RNA 간
섭 반응을 유발하여 바람직하게 표적 분자에 대한 mRNA을 차단시키는데 적합하다. 따라서, 이러한 종류의 핵산
분자는 mRNA 수준에서 당해 발현을 감소시켜 표적 분자의 발현을 감소시키는데 적합하다. 본 발명에 포함되는
CD31을 암호화하는 mRNA가 추가로 존재할 수 있음은 당업자에 의해 인지될 것이다. 보다 특히, 본원에서 서열
번호 1을 기준으로 동정된 특정 뉴클레오타이드 위치는 본원에서 제공된 기술적 교시를 기초로 당업자에 의해
당해 mRNA가 추가로 동정될 수 있다.
또한, 본 발명의 당해 측면에 따른 이본쇄 핵산은 당해 유형의 핵산 분자에 대해 본원에 기재된 임의의 디자인<68>
을 가질 수 있는 것으로 인지되어야만 한다. 또한 상기된 기작이 하부측면으로서 본원에 언급된 다양한 측면
및 디자인 원칙과 관련하여 본원에 기재된 핵산에 적용될 수 있는 바람직한 양태에 있는 것으로 인지되어야만
한다.
RNA 간섭은 짧은 간섭 RNA(siRNA)에 의해 매개되는, 동물에서 서열 특이적 전사후 유전자 사일런싱 과정을 언급<69>
한다(문헌참조: Fire et al, 1998, Nature, 391, 806). 식물에서 상응하는 과정은 일반적으로 전사후 유전자
사일런싱 또는 RNA 사일런싱으로 언급되고 또한 진균류에서는 쿠엘링(quelling)으로 언급된다. 전사후 유전자
사일런싱 과정은 다양한 군집 및 문(phyla)이 공통적으로 공유한, 외래 유전자의 발현을 차단하는데 사용되는
진화적으로 보존된 방어 기작인 것으로 사료된다(문헌참조: Fire et al, 1999, Trends Genet., 15, 358). 외
래 유전자 발현으로부터의 당해 보호는 바이러스 감염으로부터 유래된 이본쇄 RNA(dsRNA)의 생성 또는 상동성
일본쇄 RNA 또는 바이러스 게놈 RNA을 특이적으로 파괴하는 세포 반응을 통한 숙주 게놈으로의 트랜스포존 요소
의 무작위 통합에 응답하여 유도될 수 있다. 세포에서 dsRNA의 존재는 아직 완전히 특성 규명되지 않은 기작을
통해 RNAi 반응을 유발한다. 또한 동물 세포 및 특히 또한 포유동물 세포에 존재하는 당해 기작은 단백질 키나
제 PKR 및 2',5'-올리고아데닐레이트 신테타제의 dsRNA 매개 활성화로부터 비롯되어 리보뉴클레아제 L에 의한
mRNA의 비특이적 절단을 유발시키는 인터페론 반응과는 상이한 것으로 나타난다.
siRNA 분자 또는 RNAi 분자의 기본적 디자인은 대부분 크기에서 상이하고 기본적으로 핵산 분자는 이본쇄 구조<70>
를 포함한다. 이본쇄 구조는 제1 쇄 및 제2 쇄를 포함한다. 보다 바람직하게, 제1 쇄는 제1 스트레치의 연속
적인 뉴클레오타이드를 포함하고 제2 스트레치는 제2 스트레치의 연속적인 뉴클레오타이드를 포함한다. 적어도
제1 스트레치 및 제2 스트레치는 필수적으로 서로 상보적이다. 당해 상보성은 전형적으로 왓슨-크릭 염기쌍 형
성 또는 당업자에게 공지된 기타 염기쌍 형성 기작(후그스틴(Hoogsteen) 염기 쌍 형성 등)을 기초로 한다. 당
해 이본쇄 구조의 길이에 따라, 염기 상보성 측면에서 완벽한 일치는 반드시 요구되지 않는다는 것은 당업자가
인지할 것이다. 그러나, 당해 완벽한 상보성은 몇몇 양태에서 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서, 상보성 및
/또는 동일성은 적어도 75%, 80%, 85%, 90% 또는 95%이다. 대안적으로 특히 바람직한 양태에서, 상보성 및/또
는 동일성은 상보체 및/또는 동일한 핵산 분자가 본 발명에 따른 핵산 분자의 쇄중 하나에, 보다 바람직하게는
하기의 조건하에서 2개의 스트레치중 하나에 스트레치에 하이브리드화되도록 하고 이때, 상기 조건은 12 내지
16시간동안 400 mM NaCl, 40 mM PIPES pH 6.4, 1 mM EDTA, 500℃ 또는 700℃ 하이브리드화에 이어서 세척과 같
은 조건하에서 표적 유전자 전사체의 일부와 하이브리드화할 수 있는 조건이다. 각각의 반응 조건은 유럽 특허
EP 1 230 375에 기재된 것들중에 있다. 임의의 경우, 본 발명에 따른 핵산 분자는 이들이 유전자 사일런싱에
적합하고 보다 특히 RNA 간섭을 유발하기에 적합한 것이 될 수 있도록 디자인되거나 구현된다.
미스매치(mismatch)는 대부분 이본쇄 구조가 RNA 간섭 기작을 유발하는데 적합하고 바람직하게 당해 이본쇄 구<71>
조가 여전히 안정적으로 세포, 조직, 및 당해 세포, 조직 및 기관을 포함하거나 원칙적으로 포함하는 유기체에
만연된 생리학적 조건하에서 안정적으로 형성될 수 있는 경우 대부분 허용될 수 있다. 보다 바람직하게, 이본
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쇄 구조는 생리학적 완충액중에서 37℃에서 안정하다. 당업자는 이러한 종류의 미스매치가 바람직하게 코어 영
역과는 상이한 본 발명에 따른 핵산 분자내의 위치에 포함될 수 있음을 인지할 것이다.
제1 스트레치는 전형적으로 적어도 부분적으로 표적 핵산에 상보적이고 제2 스트레치는 특히 제1 및 제2 스트레<72>
치간의 관계가 주어졌을 때 각각 염기 상보성 관점에서 표적 핵산과 적어도 부분적으로 동일하다. 표적 핵산은
바람직하게 mRNA이지만 hnRNA와 같은 기타 형태의 RNA가 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자로서 적합하다.
RNA 간섭은 수십개 및 심지어 수백개의 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 쌍을 각각 포함하는 긴 핵산 분자를<73>
사용할 때 관찰될 수 있지만 보다 짧은 RNAi 분자가 일반적으로 바람직하다. 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레
치 길이에 대한 보다 바람직한 범위는 약 18개 내지 29개 연속 뉴클레오타이드, 바람직하게는 19개 내지 25개의
연속 뉴클레오타이드 및 보다 바람직하게는 19개 내지 23개의 연속 뉴클레오타이드이다. 보다 바람직하게 제1
스트레치 및 제2 스트레치 둘다는 동일한 길이를 갖는다. 추가의 양태에서, 이본쇄 구조는 바람직하게 16개 내
지 29개, 바람직하게는 18개 내지 25개, 보다 바람직하게는 19개 내지 23개 및 가장 바람직하게는 19개 내지 21
개의 쌍을 포함한다.
본 발명에 따라, 원칙적으로 CD31을 암호화하는 mRNA의 임의의 부분은 각각 당해 siRNA 분자 및 RNAi 분자의 디<74>
자인을 위해 사용될 수 있지만, 본 발명자는 놀랍게도 서열번호 1의 뉴클레오타이드 서열을 갖는 서열번호 1의
mRNA의 뉴클레오타이드 위치 1277번, 2140번 및 2391번으로 시작하는 서열이 RNA 간섭 매개 분자에 의해 해결되
는데 적합함을 밝혔다.
보다 구체적으로, 본 발명자는 놀랍게도 당해 서열 및 개시점이 특히 CD31의 발현 억제를 위해 바람직한 표적<75>
서열이지만 특히 효과적인 당해 서열에 인접하여 뉴클레오타이드 코어가 존재함을 밝혔다. 하나의 양태에서 당
해 코어는 상기 특정된 뉴클레오타이드의 마지막 9개 내지 11개 뉴클레오타이드로 이루어진 서열이다. 당해 뉴
클레오타이드로부터 개시하는 코어는 기능적 활성 이본쇄 핵산 분자가 수득되도록 연장될 수 있고 이때, 바람직
하게 기능적 활성이라 함은 CD31의 발현 억제에 영향을 미치는데 적합함을 의미한다. 당해 목적을 위해, 필수
적으로 mRNA의 상응하는 부분, 즉, 코어 서열과 동일한 제2 스트레치는 따라서 5' 말단에서 하나, 바람직하게는
수개의 뉴클레오타이드에 의해 연장되고 이와 같이 첨가된 뉴클레오타이드는 상응하는 위치에서 표적 핵산에 존
재하는 뉴클레오타이드와 필수적으로 동일하다. 또한 당해 목적을 위해, 표적 핵산과 필수적으로 상보적인 제1
쇄는 따라서 3' 말단에서 하나, 바람직하게는 수개의 뉴클레오타이드에 의해 연장되고 이와 같이 첨가된 뉴클레
오타이드는 상응하는 위치, 즉, 5' 말단에서 표적 핵산에 존재하는 뉴클레오타이드와 필수적으로 상보적이다.
당해 디자인 원칙에 따라, 본 발명에 따른 코어 서열은 다음과 같이 요약될 수 있다:<76>
5'cauccagaa3', <77>
5'acuccaaca3', 및<78>
5'agaacggaa3'<79>
이의 추가의 양태에서, 코어 서열은 본 발명에 따른 이본쇄 핵산 분자의 제2 스트레치 및 이와 필수적으로 상보<80>
적인 제1 스트레치의 뉴클레오타이드 서열과 동일하다. 여전히 추가로 바람직한 양태에서, 본 발명에 따른 이본
쇄 핵산 분자의 길이는 각각 다양한 측면 및 하부 측면과 관련하여 본원에 기재된 한계치내에 있다.
당업자는 siRNA 분자 및 RNAi 분자가 각각 현재 및 향후 디자인 원칙에 따라 다양할 수 있음을 인지할 것이다.<81>
하기에서 보다 상세하게 논의되고 하부 측면 또는 본 발명에 따른 핵산 분자의 제1 측면의 하부 측면으로서 언
급되는 몇몇 디자인 원칙이 현재 존재한다. 하나의 특정 하부 측면에 대해 기재된 모든 특징 및 양태, 즉, 핵
산의 디자인은 임의의 다른 측면 및 본 발명에 따른 핵산의 하부 측면에 적용될 수 있고 따라서 이의 각각의 양
태를 형성하며 이는 본 발명의 범위내에 있다.
제1 하부 측면은 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이고, 여기서, 제1 스트레치는 2' 위치에서 변형을 갖는 변형된<82>
뉴클레오타이드의 다수의 그룹을 포함하고 스트레치내에서 각각의 변형된 뉴클레오타이드 그룹은 뉴클레오타이
드 플랭킹 그룹에 의해 한쪽 또는 양쪽 측쇄상에서 플랭킹되고, 뉴클레오타이드의 플랭킹을 그룹을 형성하는 플
랭킹 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드이거나 변형된 뉴클레오타이드의 변형과는 상이한 변형을 갖는
뉴클레오타이드이다. 당해 디자인은 국제 특허원 WO 2004/015107에 기재된 것들중에 있다. 당해 측면에 따른
핵산은 바람직하게 리보핵산이지만 몇몇 양태에서 명시된 바와 같이 2' 위치에서 변형은 그와 같이 순수한 화학
적 관점에서 더 이상 리보뉴클레오타이드가 아닌 뉴클레오타이드를 생성시킨다. 그러나, 본 발명의 범위내에서
당해 변형된 리보뉴클레오타이드는 리보뉴클레오타이드로서 및 리보핵산으로서 당해 변형된 리보뉴클레오타이드
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를 포함하는 분자로서 간주되고 기재된다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 양태에서, 리보핵산은 이본쇄 구조의 한쪽 측쇄 및 양 측쇄상에서<83>
평활말단화되어 있다. 보다 바람직한 양태에서, 이본쇄 구조는 18개 내지 25개, 보다 바람직하게는 19개 내지
23개 및 또한 18개 또는 19개의 염기쌍을 포함한다. 보다 더 바람직한 양태에서, 당해 핵산은 제1 스트레치 및
제2 스트레치만으로 이루어진다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 추가의 양태에서, 당해 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치는 변형<84>
된 뉴클레오타이드의 다수 그룹을 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, 제1 스트레치는 또한 뉴클레오타이드의
다수의 플랭킹 그룹을 포함한다. 바람직한 양태에서, 다수의 그룹은 2개 이상의 그룹을 의미한다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 당해 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오타이드의<85>
다수 그룹을 포함한다. 추가의 바람직한 양태에서, 제2 스트레치는 또한 뉴클레오타이드의 다수의 플랭킹 그룹
을 포함한다. 바람직한 양태에서, 다수의 그룹은 2개 이상의 그룹을 의미한다.
추가의 바람직한 양태에서, 제1 및 제2 스트레치는 변형된 뉴클레오타이드 그룹 및 뉴클레오타이드의 플랭킹 그<86>
룹 둘다를 다수로 포함한다. 보다 바람직한 양태에서, 다수의, 변형된 뉴클레오타이드 그룹 및 뉴클레오타이드
플랭킹 그룹 둘다는 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치상에서 특정 패턴, 바람직하게는 규칙적인 패턴을 형성
하고 이때, 당해 패턴이 제1 및 제2 스트레치 둘다에 대해 형성되는 것이 보다 더 바람직하다. 바람직한 양태
에서, 당해 패턴은 공간적 또는 위치적 패턴이다. 제1 하부 측면에 대한 대상으로서 공간적 또는 위치적 패턴
은 (a) 뉴클레오타이드가, 이본쇄 구조를 형성하는 쇄/스트레치의 뉴클레오타이드 서열내에서의 위치에 의존하
여 변형되는 것을 의미한다. 따라서, 변형될 뉴클레오타이드가 피리미딘 또는 퓨린이든 상관없다. 차라리 (a)
비변형된 뉴클레오타이드에 상대적이고 따라서 5' 말단 및 3' 말단 각각에 상대적인 당해 뉴클레오타이드의 상
대적 위치가 결정적이다. 따라서, 각각의 쇄/스트레치를 따라 나타나는 변형은 당해 쇄/스트레치를 따라 존재
하는 개별 뉴클레오타이드의 화학적 성질에 의존하거나 이에 의해 구동되는 것이 아니라 개별 뉴클레오타이드의
위치에 의존한다. 따라서, 본 발명의 제1 하부 측면의 기술적 교시에 따라, 당해 변형 패턴은 변형되어야만 하
는 서열에 상관없이 항상 동일할 것이다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서, 변형된 뉴클레오타이드 그룹 및/또는 플랭킹<87>
뉴클레오타이드 그룹은 다수의 뉴클레오타이드를 포함하고, 이때, 당해 수는 1개 뉴클레오타이드 내지 10개 뉴
클레오타이드를 포함하는 그룹으로부터 선택된다. 본원에 특정된 임의의 범위와 관련하여, 이것은 각각의 범위
가 당해 범위를 한정하는 2개의 수치를 포함하여 범위를 한정하는데 사용되는 각각의 수치 사이의 임의의 개별
정수를 기재하는 것으로 이해되어야만 한다. 본 경우에, 당해 그룹은 따라서 1개의 뉴클레오타이드, 2개의 뉴클
레오타이드, 3개의 뉴클레오타이드, 4개의 뉴클레오타이드, 5개의 뉴클레오타이드, 6개의 뉴클레오타이드, 7개
의 뉴클레오타이드, 8개의 뉴클레오타이드, 9개의 뉴클레오타이드 및 10개의 뉴클레오타이드를 포함한다..
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 제1 스트레치의 변형된 뉴클레오타이드의 패턴<88>
은 당해 제2 스트레치의 변형된 뉴클레오타이드 패턴과 동일하다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서, 제1 스트레치의 패턴은 제2 스트레치의 패턴과<89>
일치한다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 당해 제1 스트레치의 패턴은 제2 스트레치의 패<90>
턴에 비해 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 변화된다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 양태에서, 2' 위치에서의 변형은 아미노, 플루오로, 메톡시, 알콕<91>
시 및 알킬을 포함하는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 이본쇄 구조는 평활 말단화되어 있다.<92>
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서, 이본쇄 구조는 이본쇄 구조의 양측면에서 평활<93>
말단화되어 있다.
본 발명의 제1 하부측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 이본쇄 구조는 제1 쇄의 5' 말단 및 제2 쇄의 3'<94>
말단에 의해 정의되는 이본쇄 구조의 측면에서 평활 말단화되어 있다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 이본쇄 구조는 제1 쇄의 3'말단 및 제2 쇄의 5'<95>
말단에 의해 정의되는 이본쇄 구조의 측면에서 평활 말단화되어 있다.
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본 발명의 제1 하부측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 2개의 쇄중 하나 이상은 5' 말단에서 하나 이상<96>
의 뉴클레오타이드의 오버행(overhang)을 갖는다.
본 발명의 제1 하부측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서 당해 오버행은 하나 이상의 데옥시리보뉴클레오<97>
타이드로 이루어진다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 추가의 양태에서, 당해 쇄의 하나 이상은 3' 말단에서 하나 이상의<98>
뉴클레오타이드의 오버행을 갖는다.
제1 하부 측면의 리보핵산의 양태에서, 이본쇄 구조의 길이는 약 17개 내지 25개의 염기쌍이고 보다 바람직하게<99>
는 19개 내지 23개의 염기쌍 또는 18개 또는 19개 염기쌍이다.
제1 하부 측면의 리보핵산의 또 다른 양태에서, 제1 쇄의 길이 및/또는 제2 쇄의 길이는 서로 독립적으로 약 15<100>
개 내지 약 23개의 염기쌍, 19개 내지 23개의 염기쌍 및 18개 또는 19개의 염기쌍 범위를 포함하는 그룹으로부
터 선택된다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서, 제1 쇄와 표적 핵산간의 상보성은 완벽하다.<101>
제1 하부측면에 따른 리보핵산의 양태에서, 이중나선(duplex)은 제1 쇄와 표적 핵산간에 형성되고 15개 이상의<102>
뉴클레오타이드를 포함하며, 이때 이본쇄 구조를 형성하는 제1 쇄와 표적 핵산간에는 하나의 미스매치 또는 2개
의 미스매치가 존재한다.
제1 하부측면에 따른 리보핵산의 양태에서, 제1 쇄와 제2 쇄 둘다는 각각 하나 이상의 변형된 뉴클레오타이드<103>
그룹 및 하나 이상의 플랭킹 뉴클레오타이드 그룹을 포함하고, 이때 변형된 뉴클레오타이드의 각 그룹은 하나
이상의 뉴클레오타이드를 포함하고 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹 각각은 하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함하며
제1 쇄의 변형된 뉴클레오타이드 그룹 각각은 제2 쇄상의 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹과 정렬되며 제1 쇄의 최
말단 5'뉴클레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 그룹의 뉴클레오타이드이고 제2 쇄의 최말단 3' 뉴클레오타이
드는 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹의 뉴클레오타이드이다. 바람직한 양태에서, 제1 쇄 및 제2 쇄 각각은 2개의
이상의 변형된 뉴클레오타이드 그룹 및 2개 이상의 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹을 포함한다. 보다 더 바람직한
양태에서, 각각의 임의의 개별 그룹은 단일 뉴클레오타이드로 이루어진다.
제1 하부측면에 따른 리보핵산의 바람직한양태에서, 변형된 뉴클레오타이드 그룹 각각은 단일 뉴클레오타이드로<104>
이루어지고/지거나 각각의 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹은 단일 뉴클레오타이드로 이루어진다.
제1 하부측면에 따른 리보핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄에 대해 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹을 형성하는 뉴클<105>
레오타이드는 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 형성하는 뉴클레오타이드에 대해 3' 방향으로 배열되는 비변형된
뉴클레오타이드이고, 제2 쇄에 대해 변형된 뉴클레오타이드 그룹을 형성하는 뉴클레오타이드는 뉴클레오타이드
플랭킹 그룹을 형성하는 뉴클레오타이드에 대해 5' 방향으로 배열된 변형된 뉴클레오타이드이다.
제1 하부측면에 따른 리보핵산의 또 다른 양태에서, 제1 쇄는 8개 내지 12개, 바람직하게는 9개 내지 11개의 변<106>
형된 뉴클레오타이드 그룹을 포함하고 제2 쇄는 7개 내지 11개, 바람직하게는 8개 내지 10개의 변형된 뉴클레오
타이드 그룹을 포함한다.
본 발명의 범위내에서 상기 특정된 것은 또한 각각 제1 및 제2 스트레치에 적용될 있다. 이것은 특히 당해 쇄<107>
가 단지 스트레치로 이루어지는 양태에 대해서도 사실이다.
디자인될 수 있는 당해 제1 하부측면에 따른 리보핵산 분자는 제1 쇄에서 본원에서 유리 5' OH-그룹으로서도 언<108>
급되는 유리 5' 하이드록실 그룹을 갖는다. 유리 5' OH-그룹은 제1 쇄를 형성하는 최말단 뉴클레오타이드가 존
재하고 이는 이어서 변형되어 있지 않고 특히 말단 변형에 의해 변형되어 있지 않음을 의미한다. 전형적으로,
제2 쇄의 말단 5' 하이드록시 그룹 각각은 또한 비변형된 방식으로 존재한다. 보다 바람직한 양태에서, 또한
제1 쇄 및 제1 스트레치의 3' 말단은 변형되어 있지 않아 본원에서 또는 3'OH 그룹으로서도 언급되는 유리 OH
그룹이 존재하고 이때, 5' 말단 뉴클레오타이드의 디자인은 상기된 임의의 양태중 하나이다. 바람직하게, 당해
유리 OH-그룹은 각각 또한 제2 쇄 및 제2 스트레치의 3' 말단에 존재한다. 본 발명에 따라 이전에 기재된 바와
같은 리보핵산의 또 다른 양태에서, 제1 쇄 및 제1 스트레치의 3' 말단은 각각 3' 말단에서 말단이 변형될 수
있다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 유리 5' OH-그룹 및 3' OH-그룹은 또한 폴리뉴클레오타이드, 즉 핵산 또는 쇄<109>
및 스트레치 각각의 5' 말단 및 3 ' 말단에서 각각의 최말단 뉴클레오타이드는 OH- 그룹이 존재하는 이본쇄 구
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조를 형성함을 지적한다. 당해 OH-그룹은 뉴클레오타이드의 당 잔기로부터 기원할 수 있고, 보다 바람직하게는
5' OH-그룹의 경우에 5' 위치로부터 기원할 수 있으며/있거나 3' OH-그룹의 경우에 3' 위치로부터 기원하거나
각각의 달 뉴클레오타이드의 당 잔기에 부착된 포스페이트 그룹으로부터 기원할 수 있다. 당해 포스페이트 그
룹은 원칙적으로 뉴클레오타이드의 당 잔기의 임의의 OH 그룹에 부착될 수 있다. 바람직하게, 포스페이트 그룹
은 유리 5' OH 그룹의 경우에 당 잔기의 5' OH 그룹 및/또는 유리 3' OH 그룹의 경우에 당 잔기의 3' OH 그룹에
부착되어 있으며 이들은 본원에서 여전히 유리 5' OH 그룹 또는 3' OH 그룹으로서 언급된다.
제1 하부측면의 임의의 양태와 관련하여 본원에서 사용된 바와 같이, 용어 말단 변형은 제1 및/또는 제2 쇄의<110>
5' 또는 3' 뉴클레오타이드에 부착된 화학적 실체를 의미한다. 당해 말단 변형에 대한 예는 무엇보다 유럽 특
허 EP O 586 520 Bl 또는 EP O 618 925 Bl에 기재된 바와 같이 역전된(데옥시) 비염기성, 아미노, 플루오로,
클로로, 브로모, CN, CF, 메톡시, 이미다졸, 카복실레이트, 티오에이트, C1 내지 C10 저급 알킬, 치환된 저급 알
킬, 알크아릴 또는 아르알킬, OCF3, OCN, 0-, S-, 또는 N-알킬; 0-, S-, 또는 N-알케닐; SOCH3; SO2CH3; ONO2;
NO2, N3; 헤테로자이클로알킬; 헤테로자이클로알크아릴; 아미노알킬아미노; 폴리알킬아미노 또는 치환된 실릴을
포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에 사용된 바와 같이, 알킬 또는 "알킬"을 포함하는 임의의 용어는 1 내지 12개, 바람직하게는 1 내지 6개<111>
및 보다 바람직하게는 1 내지 2개의 탄소원자를 포함하는 임의의 탄소원자쇄를 의미한다.
추가의 말단 변형은 비오틴 그룹이다. 당해 비오틴 그룹은 바람직하게 제1 및/또는 제2 쇄 의 5' 또는 3' 뉴클<112>
레오타이드 또는 양 말단에 부착될 수 있다. 보다 바람직한 양태에서, 비오틴 그룹은 폴리펩타이드 또는 단백
질에 커플링된다. 또한 본 발명의 범위내에서 폴리펩타이드 또는 단백질은 기타 언급된 임의의 말단 변형을 통
해 부착된다. 당해 폴리펩타이드 또는 단백질은 본 발명의 핵산 분자에 추가의 특징을 부여할 수 있다. 무엇보
다, 폴리펩타이드 또는 단백질은 또 다른 분자에 대한 리간드로서 작용할 수 있다. 당해 기타 분자가 수용체인
경우, 수용체의 기능 및 활성은 결합 리간드에 의해 활성화될 수 있다. 수용체는 리간드 결합된 본 발명의 핵
산 분자의 효과적인 형질감염을 허용하는 내재화 활성을 보여줄 수 있다. 본 발명의 핵산 분자에 커플링될 리
간드에 대한 예는 VEGF이고 상응하는 수용체는 VEGF 수용체이다.
상이한 종류의 말단 변형을 갖는 본 발명의 RNAi의 각종 가능한 양태는 하기의 표 1에 제공한다.<113>
[표 1]<114>
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본 발명에 따른 간섭 리보핵산의 각종 양태<115>
<116>
본원에 기재된 바와 같은 각종 말단 변형은 바람직하게 리보핵산의 뉴클레오타이드의 리보스 잔기에 위치한다.<117>
보다 특히, 말단 변형은 2' OH, 3' OH 및 5' OH 위치를 포함하지만 이에 제한되지 않는 리보스 잔기의 임의의
OH 그룹에 부착되거나 대체할 수 있고, 단, 이와 같이 변형된 뉴클레오타이드는 말단 뉴클레오타이드이다. 역전
된 비염기성은 뉴클레오타이드, 즉 뉴클레오염기 잔기를 갖지 않는 데스오시리보뉴클레오타이드 또는 리보뉴클
레오타이드이다. 이러한 종류의 화합물은 무엇보다 문헌[참조: Sternberger et al., 2002]에 기재되어 있다.
임의의 상기 언급된 말단 변형은 표 1에 나타낸 RNAi의 각종 양태와 연계하여 사용될 수 있다. 이와 관련하여,<118>
임의의 RNAi 형태, 또는 센스 쇄가 바람직하게 말단 변형을 가짐에 의해, 보다 바람직하게는 5' 말단 변형에 의
해 불활성화된 본원에 기재된 양태가 특히 유리함을 주지해야만 한다. 이것은 세포에서 비관련 일본쇄 RNA를
방해할 수 있는 본원에 기재된 리보해간의 제2 쇄에 상응하는 센스 쇄의 불활성화로부터 비롯된다. 따라서, 세
포의 트랜스크립톰의 발현 및 보다 특히 이의 해독 패턴은 보다 특이적으로 영향받는다. 당해 효과는 또한 오
프-표적 효과로서 언급된다. 표 1를 참조하여 양태 7 및 8로서 묘사된 당해 양태는 특히 당해 변형이 RNAi(이것
은 제2 쇄이다)의 부분을 불활성화(표적 비특이적)시킴에 따라서 본 발명에 따른 RNAi가 특이적 리보핵산 및 단
백질을 각각 녹다운시키는데 사용될세포 또는 유사 시스템에서 제2 쇄와 일본쇄 RNA의 비특이적 상호작용을 감
소시킴으로서 당해 의미에서 특히 유리하다.
추가의 양태에서, 제1 하부측면에 따른 핵산은 리보핵산의 5 '-말단에서 오버행을 갖는다. 보다 특히, 당해 오<119>
버행은 원칙적으로 본 발명에 따른 리보핵산의 제1 쇄 및 제2 쇄중 어느 하나 또는 둘다에 존재할 수 있다. 당
해 오버행의 길이는 1개의 뉴클레오타이드로 짧거나 2 내지 8개의 뉴클레오타이드 정도로 길 수 있고 바람직하
게는 2, 4, 6 또는 8개 뉴클레오타이드이다. 본 발명에서 5' 오버행은 본 발명에 다른 리보핵산의 제1 쇄 및/
또는 제2 쇄상에 위치할 수 있다. 오버행을 형성하는 뉴클레오타이드는 (a) 데스옥시리보뉴클레오타이드, (a)
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리보뉴클레오타이드 또는 이의 조합체일 수 있다.
오버행은 바람직하게 하나 이상의 데스옥시리보뉴클레오타이드를 포함하고, 이때, 당해 하나의 데스옥시리보뉴<120>
클레오타이드는 바람직하게 최외측 5' 말단이다. 본 발명에서 본 발명의 리보핵산 각각의 대응 쇄의 3' 말단
은 오버행을 갖지 않고 보다 바람직하게는 데스옥시리보뉴클레오타이드 오버행을 갖지 않는다. 여기서 다시, 임
의의 본 발명의 리보핵산은 표 1과 관련하여 명시된 바와 같은 말단 변형 및/또는 본원에 명시된 발단 변형을
가질 수 있다.
연속 뉴클레오타이드 스트레치를 사용하여 스트레치를 형성하는 뉴클레오타이드 변형 패턴은 단일 뉴클레오타이<121>
드 또는 서로가 쇄 포스포디에스테르 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있거나 적어도 부분적으로 포스포
로티오에이트 결합을 통해 서로 공유적으로 연결되어 있는 뉴클레오타이드 그룹이 당해 종류의 변형을 보여주는
양태로 실현될 수 있다. 본원에서 변형된 뉴클레오타이드로서도 언급되는 당해 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오
타이드 그룹이 당해 스트레치의 5' 말단 또는 3' 말단을 형성하지 않는 경우, 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타
이드 그룹은 선행 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 그룹 변형을 갖지 않는 뉴클레오타이드 양측쇄상에 존재
한다. 그러나 이러한 종류의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 그룹은 상이한 변형을 가질 수 있음을 주지
해야한다. 이러한 종류의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 그룹은 또한 본원에서 뉴클레오타이드 플랭킹
그룹으로서 언급된다. 각각 변형된 뉴클레오타이드 및 변형된 뉴클레오타이드 그룹, 및 비변형되거나 상이하게
변형된 뉴클레오타이드 또는 비변형되거나 상이하게 변형된 뉴클레오타이드 그룹으로 이루어진 당해 서열은 1회
또는 수회 반복될 수 있다. 바람직하게, 당해 서열은 1회 이상 반복된다. 명백하게 하기 위해, 당해 패턴은 하
기에서 보다 상세하게 논의되고 일반적으로 변형된 뉴클레오타이드 그룹 또는 비변형된 뉴클레오타이드 그룹을
언급하고, 이때, 당해 그룹 각각은 실질적으로 적게 단일 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바
와 같이 비변형된 뉴클레오타이드는 각각의 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드 그룹을 형성하는 뉴클레오타이
드에서 임의의 상기 언급된 변형을 갖지 않거나 각각 변형된 뉴클레오타이드 및 뉴클레오타이드 그룹과는 상이
한 변형을 갖는다는 것을 의미한다.
또한 본 발명에서, 변형된 뉴클레오타이드 변형과는 실질적으로 상이한 방식으로 변형된 비변형된 뉴클레오타이<122>
드의 변형은 동일하거나 심지어 당해 비변형된 뉴클레오타이드를 형성하는 각종 뉴클레오타이드 또는 각종 뉴클
레오타이드 플랭킹 그룹과 상이할 수 있다.
변형된 뉴클레오타이드 및 비변형된 뉴클레오타이드의 패턴은 쇄 또는 스트레치의 5' 말단 뉴클레오타이드가 변<123>
형된 뉴클레오타이드 그룹으로 개시하거나 비변형된 뉴클레오타이드 그룹으로 개시하도록 하는 방식일 수 있다.
그러나, 또 다른 양태에서, 또한 5' 말단 뉴클레오타이드는 비변형된 그룹의 뉴클레오타이드에 의해 형성될 수
있다.
이러한 종류의 패턴은 간섭 RNA의 제1 스트레치 또는 제2 스트레치상에 또는 둘다에서 실현될 수 있다. 이것은<124>
각각 제1 쇄 및 p2 쇄에 동일하게 적용한다. siRNA 이중나선의 표적 상보적 쇄상의 5' 포스페이트는 siRNA 기
능을 위해 필요하고 이는 세포가 유리 5' OH(인산화될 수 있는)을 통해 siRNA의 확실성을 조사하고 당해 확실한
siRNA만이 표적 RNA 파괴를 지시하도록함을 시사하는 것임을 주지해야만 한다(문헌참조: Nykanen, 2001 #94).
바람직하게, 제1 스트레치는 즉, 변형된 뉴클레오타이드 그룹 및 뉴클레오타이드 플랭킹 그룹의 일종의 변형된<125>
뉴클레오타이드 및 비변형된 뉴클레오타이드 패턴을 보여주는 반면, 제2 스트레치는 이러한 종류의 패턴을 보여
주지 않는다. 이것은 제1 스트레치가 실제로 RNA 간섭 현상에 기본적인 표적 특이적 분해 과정을 위해 보다 중
요한 하나이고 특별한 이유 때문에 제2 스트레치는 화학적으로 변형됨에 따라 RNA 간섭을 매개하는데 기능적이
지 않음으로서 유용할 수 있다. 이것은 각각 제1 쇄와 제2 쇄에 동일하게 적용된다.
그러나, 또한 본 발명에서 제1 스트레치 및 제2 스트레치 둘다는 이러한 종류의 패턴을 갖고 있다.<126>
바람직하게, 변형 및 비변형 패턴은 제1 스트레치 및 제2 스트레치 둘다에 대해 동일하다. 이것은 각각 제1 쇄
및 제2 쇄에 동일하게 적용된다.
바람직한 양태에서, 제2 스트레치를 형성하고 제1 스트레치의 변형된 뉴클레오타이드 그룹에 상응하는 뉴클레오<127>
타이드 그룹은 또한 변형되는 반면 제2 스트레치의 또는 이를 형성하는 비변형된 뉴클레오타이드 그룹은 제1 스
트레치의 또는 이를 형성하는 비변형된 뉴클레오타이드 그룹에 상응한다. 또 다르게는 각각 제2 스트레치 및
제2 쇄의 변형 패턴과 비교하여 각각 제1 스트레치 및 제1 쇄의 변형 패턴에는 상 전이가 있다. 바람직하게,
당해 전이는 제1 스트레치의 변형된 뉴클레오타이드 그룹은 제2 스트레치의 비변형된 뉴클레오타이드 그룹에 상
응하도록하는 것이 그 반대의 경우도 마찬가지이다. 또한 본 발명에서 변형 패턴의 상 전이는 완전하지 않고
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중첩한다. 이것은 각각 제1 쇄 및 제2 쇄에 동일하게 적용된다.
바람직한 양태에서, 각각 쇄 및 스트레치의 말단에서 제2 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비변<128>
형된 뉴클레오타이드 그룹의 개시부이다. 바람직하게, 당해 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비변형된 뉴클레오타
이드 그룹은 각각 제1 쇄 및 제2 쇄의 5' 말단에 위치하고 보다 더 바람직하게는 제1 쇄의 5' 말단에 위치한다.
추가의 바람직한 양태에서, 비변형된 뉴클레오타이드 또는 비변형된 뉴클레오타이드 그룹은 각각 제1 쇄 및 제1
스트레치의 5' 말단에 위치한다. 바람직한 양태에서, 당해 패턴은 단일의 변형되고 비변형된 뉴클레오타이드가
교대로 존재하는 것으로 이루어진다.
본 발명의 당해 측면의 추가의 바람직한 양태에서 갑섭 리보핵산 대상체는 2개의 쇄를 포함하고, 여기서, 2'-O-<129>
메틸 변형된 뉴클레오타이드 및 비변형된 뉴클레오타이드, 바람직하게 2'-O-메틸 변형된 것이 아닌 뉴클레오타
이드는 또 다른 방식으로 양 쇄에 혼입되고 이는 2번째 마다 뉴클레오타이드가 각각 2'-O-변형되고 비변형된 뉴
클레오타이드임을 의미한다. 이것은 제1 쇄상에서 하나의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드에 이어서 비변형된
뉴클레오타이드가 존재하고 이어서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드의 순서등으로 존재함을 의미한다. 2'-
O-메틸 변형 및 비변형의 동일한 서열은 제2 쇄상에 존재하고 이때, 바람직하게는 상 전이가 존재하여 제1 쇄상
의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드는 제2 쇄상의 비변형된 뉴클레오타이드와 염기쌍을 형성하고 그 반대도 마
찬가지이다. 당해 특정 정렬, 즉 양쇄상에 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드 및 비변형된 뉴클레오타이드는특
히 짧은 간섭 리보핵산, 즉 짧은 염기쌍 이본쇄 리보핵산인 경우에서 바람직한데 그 이유는 본 발명이 특정 이
론에 얽매이고 싶지 않지만 특정 반발력이 2개의 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드 사이에 존재하여 이것이 당
해 이중나선 및 특히 짧은 이중나선을 불안정화시키기 때문인 것으로 추정된다. 특정 정렬에 대해, 이것은 안
티센스 쇄가 5' 말단에서 2'-O-메틸 변형된 뉴클레오타이드와 개시하는 경우 바람직하고 후속적으로 제2 뉴클레
오타이드가 비변형되고 제3, 제5 및 제7 등의 뉴클레오타이드가 따라서 다시 2'-O-메틸 변형되어 있는 반면 제
2, 제4, 제6 및 제8 등의 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드이다. 다시, 특정 이론에 얽매이고 싶지
않지만 이의 중요성이 임의의 변형을 포함하지 말아야 하는 안티센스 쇄의 5' 말단에서 제2, 및 임의로 제4, 제
6, 제8 및/또는 유사 위치 때문일 수 있고 반면, 5' 최말단 뉴클레오타이드, 즉 안티센스 쇄의 제1 5' 말단 뉴
클레오타이드가 변형될 수 있는 안티센스 쇄에서 또는 안티센스 쇄의 제1, 임의로 제4, 제5 및 유사 위치에서와
같은 임의의 홀수위치에서 당해 변형을 나타낼 수 있기 때문인 것처럼 보인다. 추가의 양태에서, 각각 변형되
고 비변형된 뉴클레오타이드의 변형 및 비변형은 본원에 기재된 것중 임의의 하나일 수 있다. 보다 특정 양태에
서, 본 발명에 따른 이본쇄 핵산 분자는 19개 내지 23개 연속 뉴클레오타이드의 제1 쇄 및 19개 내지 23개 연속
뉴클레오타이드의 제2 쇄로 이루어지고 이때, 제1 쇄 및 제2 쇄는 필수적으로 서로 상보저이고 보다 바람직하게
는 동일한 길이를 갖는다. 추가로, 당해 보다 특정한 양태에서 이본쇄 구조는 양말단에서 평활말단화되어 있다.
표적 핵산, 즉 CD31에 대한 mRNA과 필수적으로 상보적인 제1 쇄는 2'O-Me 그룹을 형성하는 2' OH 그룹에서 메틸
화된 뉴크레오타이드와 함게 5' 말단에서 시작한다. 제1 쇄의 2번째 뉴클레오타이드 마다 동일한 변형, 즉 2'
OH 그룹에서 메틸화되어 있다. 따라서, 제1 쇄의 제1, 제3 및 제5 위치, 즉 임의의 홀수 뉴클레오타이드 위치
는 당해 방식으로 변형되어 있다. 제1 쇄의 짝수 위치에서 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드이거나 변
형된 뉴클레오타이드이고 이때, 변형된 경우, 변형은 제1 쇄의 홀수 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드
변형과 상이하다. 바람직하게 제1 쇄와 동일한 수의 뉴클레오타이드를 포함하는 제2 쇄는 제2, 제4, 및 제6 등
의 위치, 즉, 5' -> 3' 방향인 본원에서의 통상적인 계수 방향과 반대로 계수할 때, 즉 3' -> 5' 방향으로 계수
할 때 임의의 짝수의 뉴클레오타이드에서 변형된 뉴클레오타이드를 갖는다. 임의의 다른 뉴클레오타이드, 즉,
홀수 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드는 비변형된 뉴클레오타이드 또는 변형된 뉴클레오타이드이고
이때, 변형된 경우 당해 변형은 제2 쇄의 짝수 뉴클레오타이드 위치에서의 뉴클레오타이드 변형과 상이하다.
따라서, 제2 쇄는 상기 관점에서 비변형된 뉴클레오타이드와 함께 5' 말단에서 개시한다. 보다 바람직한 양태에<130>
서, 제1 및 제2 쇄의 변형된 뉴클레오타이드의 변형은 동일하고 제1 쇄 및 제2 쇄의 비변형된 뉴클레오타이드의
변형은 또한 동일하다. 바람직한 양태에서, 안티센스 쇄의 5' 말단은 세포, 바람직하게는 본 발명의 핵산 분자
가 활성 또는 기능적이어야만 하거나 포스페이트 그룹을 갖는 표적 세포에서 인산화될 수 있다. 센스 쇄의 5'
말단은 바람직하게 또한 변형되어 있고 보다 바람직하게는 본원에 기재된 바와 같이 변형되어 있다. 임의의
3' 말단 또는 둘다는 한 양태에서 말단 포스페이트를 갖는다.
본 발명에서, 이본쇄 구조는 2개의 별도의 쇄, 즉, 제1 쇄 및 제2 쇄에 의해 형성된다. 그러나, 또한 본 발명에<131>
서 제1 쇄 및 제2 쇄는 서로 공유적으로 연결되어 있다. 당해 연결은 각각 제1 쇄 및 제2 쇄를 형성하는 임의
의 뉴클레오타이드 사이에서 일어날 수 있다. 그러나, 당해 2개 쇄간의 연결은 이본쇄 구조중 하나의 말단 또는
2개의 말단에 보다 인접하게 형성되는 것이 바람직하다. 당해 연결은 공유 또는 비공유 연결에 의해 형성될 수
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있다. 공유 연결은 2개의 쇄를 1회 또는 수회 연결시키고 하나 또는 여러 위치에서 바람직하게 메틸렌 블루 및
이작용성 그룹을 포함하는 그룹으로부터 선택되는 화합물에 의해 형성될 수 있다. 당해 이작용성 그룹은 바람
직하게 비스(2-클로로에틸)아민, N-아세틸-N'-(p-글리옥실벤조일)시스타민, 4-티오우라실 및 프소랄렌을 포함하
는 그룹으로부터 선택된다.
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄 및 제2 쇄는 루프 구조에 의해 연결된다.<132>
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 바람직한 양태에서, 루프 구조는 비핵산 중합체로 이루어진다.<133>
이의 바람직한 양태에서, 비핵산 중합체는 폴리에틸렌 글리콜이다. <134>
본 발명의 제1 하부 측면에 따른 리보핵산의 양태에서, 제1 쇄의 5'-말단은 제2 쇄의 3' 말단에 연결된다.<135>
본 발명의 임의의 측면에 따른 리보핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄의 3'-말단은 제2 쇄의 5'-말단에 연결된다.<136>
하나의 양태에서 루프는 핵산으로 이루어져 있다. 본원에 사용된 바와 같이 문헌[참조: Elayadi and Corey<137>
(2001) Curr Opin Investig Drugs. 2(4):558-61. Review; (Drum and Wengel (2001) Curr Opin MoI Ther.
3(3):239-43]에 기재된 LNA ; 및 PNA은 핵산으로서 간주되고 또한 루프 형성 중합체로서 사용될 수 있다. 기본
적으로, 제1 쇄의 5'-말단은 제2 쇄의 3'-말단에 연결될 수 있다. 다르게는, 제1 쇄의 3'-말단은 제2 쇄의 5'-
말단에 연결될 수 있다. 당해 루프 구조를 형성하는 뉴클레오타이드 서열은 일반적으로 중요하지 않은 것으로
서 간주된다. 그러나, 당해 루프를 형성하는 당해 뉴클레오타이드 서열을 형성하는 뉴클레오타이드서열 또는
유니트의 길이는 공간적 이유 때문에 중요한 것처럼 보인다. 따라서, 4개 뉴클레오타이드 또는 뉴클레오타이드
유사체의 최소 길이는 요구되는 루프 구조를 형성하는데 적합한 것처럼 보인다. 원칙적으로, 하이드리드화될 양
스트레치 또는 쇄간의 힌지 또는 링크를 형성하는 뉴클레오타이드의 최대 수는 제한되지 않는다. 그러나, 폴리
뉴클레오타이드가 보다 길수록 2차 및 3차 구조 형성될 가능성이 높아지고 따라서 스트레치의 요구되는 배향이
영향을 받는다. 바람직하게, 힌지를 형성하는 뉴클레오타이드의 최대수는 약 12개의 뉴클레오타이드 또는 뉴클
레오타이드 유사체이다. 본원의 기재에서 상기된 임의의 디자인은 각각 , 본원에 기재되고 당업계에 공지된 임
의의 기타 디자인과 조합될 수 있고, 즉 복귀 폴딩이 루프 구조 또는 유사 구조를 통해 일어날 수 있도록 하는
방식으로 2개의 쇄가 공유적으로 연결됨에 의해 조합될 수 있다.
본 발명자는 놀랍게도 루프가 안티센스 쇄, 즉 본 발명에 다른 리보핵산의 제1 쇄의 3'에 위치하는 경우, 이러<138>
한 종류의 RNAi의 활성은 안티센스 쇄의 루프 5'에 위치하는 것과 비교하여 보다 높다. 따라서, 안티센스 쇄
및 센스 쇄, 각각 제1 쇄 및 제2 쇄와 상대적인 루프의 특정 배열은 중요하고 따라서 배향이 아무 관련이 없다
고 선행 기술에서 표명된 이해와는 대조적이다. 그러나, 이것은 본원에서 제공된 실험을 통해서라도 사실이 아
닌 것처럼 보인다. 선행 기술에서 표명된 이해는 임의의 RNAi가 프로세싱을 거치게 되고 이동안에 비 루프 연
결된 RNAi가 생성된다는 추측을 기초로 한 것이다. 그러나, 이것이 그렇다면, 안티센스의 3'에 위치된 루프를
갖는 당해 구조에 대해 명백하게 관찰된 활성 증가는 설명될 수 없었다. 따라서, 당해 종류의 작은 간섭 RNAi
의 5' -> 3' 방향으로의 바람직한 정렬은 제2쇄 - 루프 - 제1 쇄이다. 각각의 작제물은 적합한 벡터 시스템으
로 혼입될 수 있다. 바람직하게, 당해 벡터는 RNAi의 발현용 프로모터를 포함한다. 바람직하게 각각의 프로모
터는 pol III이고 보다 바람직하게 당해 프로모터는 문헌[참조:Good et al. (1997) Gene Ther, 4, 45-5]에 기
재된 바와 같은 U6, H1, 7SK 프로모터이다.
본 발명의 제1 측면의 제2 하부 측면은 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이고 이때, 제1 스트레치 및/또는 제2 스<139>
트레치는 3' 말단에서 디뉴클레오타이드를 포함하고, 이때 당해 디뉴클레오타이드는 바람직하게 TT이다. 바람
직한 양태에서, 제1 스트레치 및/또는 제2 스트레치의 길이는 18개 내지 23개의 뉴클레오타이드로 이루어지고
보다 바람직하게 이본쇄 구조는 18개 내지 23개 및 보다 바람직하게는 19개 내지 21개의 염기쌍을 포함한다.
당해 하부 측면과 관련된 핵산의 디자인은 예를 들어, 국제 특허원 제WO 01/75164호에 보다 상세하게 기재되어
있다.
본 발명의 제1 측면의 제3 하부 측면은 본 발명에 따른 핵산에 관한 것이고, 이때 제1 및/또는 제2 스트레치는<140>
3' 말단에 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다. 당해 하부 측면과 관련된 핵산의 디자인은 국제
특허원 제WO02/44321호에서 보다 상세하게 기재되어 있다. 보다 바람직하게, 당해 오버행은 리보핵산이다. 바
람직한 양태에서, 본원에서 정의된 바와 같은 각각의 쇄 및 보다 바람직하게는 각각의 스트레치는 19개 내지 25
개의 뉴클레오타이드 길이를 갖고, 이때, 보다 바람직하게 당해 쇄는 스트레치로 이루어진다. 바람직한 양태에
서, 본 발명에 따른 핵산의 이본쇄 구조는 17개 내지 25개 염기쌍, 바람직하게는 19개 내지 23개 염기쌍 및 보
다 바람직하게는 19개 내지 21개 염기쌍을 포함한다.
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본 발명의 제1 측면의 제4 하부측면은 본 발명에 다른 핵산에 관한 것이고, 이때 제1 및/또는 제2 스트레치는<141>
3' 말단에서 1 내지 5개의 뉴클레오타이드의 오버행을 포함한다. 당해 하부 측면과 관련된 핵산의 디자인은 WO
02/44321에 기재되어 있다.
본 발명의 제1 측면의 제5 하부 측면에서, 본 발명에 따른 핵산은 바람직하게 RNA 간섭을 통해 CD31 mRNA의 절<142>
단을 지시하는 화학적으로 합성된 이본쇄 짧은 간섭 핵산(siRNA) 분자인 이본쇄 핵산이고, 이때 당해 siNA 분자
의 각각의 쇄는 길이가 18개 내지 27개 또는 19개 내지 29개의 뉴클레오타이드이고 당해 siNA 분자는 하나 이상
의 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드 비 뉴클레오타이드를 포함한다. 당해 하부측면과 관련된 핵산의 디자인
은 국제 특허원 WO03/070910 및 UK 특허 제2 397 062호에 보다 상세하게 기재되어 있다.
이의 하나의 양태에서, siNA 분자는 리보뉴클레오타이드를 포함하지 않는다. 또 다른 양태에서, siNA 분자는<143>
하나 이상의 뉴클레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 뉴
클레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 뉴클
레오타이드를 포함한다. 또 다른 양태에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 뉴클레오타이드를
포함한다. 또 다른 양태에서 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드는 포스포로티오에이트 상호뉴클레오타이드 연
결을 포함한다. 추가의 양태에서, 비-뉴클레오타이드는 비염기성 잔기를 포함하고, 이때 바람직하게 비염기성
잔기는 역전된 데옥시 염기성 잔기를 포함한다. 또 다른 양태에서, 비-뉴클레오타이드는 글리세릴 잔기를 포함
한다.
추가의 양태에서, 제1 쇄 및 제2 쇄는 링커 분자를 통해 연결된다. 바람직하게, 링커 분자는 폴리뉴클레오타이<144>
드 링커이다. 또한, 링커 분자는 비-뉴클레오타이드 링커이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제2 쇄중의 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 피리미딘 뉴<145>
클레오타이드이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제2 쇄중 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이<146>
드이다.
제5 하부측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제2 쇄중의 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로<147>
피리미딘 뉴클레오타이드이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제2 쇄는 5' 말단, 3' 말단 또는 5' 말단 및 3' 말단 둘다에서<148>
말단 캡 잔기를 포함한다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄중 피리미딘 뉴클레오타이드는 2'-데옥시-2'-플루오로 피<149>
리미딘 뉴클레오타이드이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄중 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-O-메틸 퓨린 뉴클레오타이<150>
드이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄중 퓨린 뉴클레오타이드는 2'-데옥시 퓨린 뉴클레오타이<151>
드이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄는 제1 쇄의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 상호뉴클레<152>
오타이드 연결을 포함한다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄는 제1 쇄의 3' 말단에서 글리세릴 변형을 포함한다.<153>
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄 및 제2 쇄의 약 19개 뉴클레오타이드는 염기쌍을 형성하<154>
고 이때 바람직하게 siNA 분자의 각 쇄의 2개 이상의 3' 말단 뉴클레오타이드는 기타 쇄의 뉴클레오타이드와 염
기쌍을 형성하지 않는다. 바람직하게, siNA 분자의 각쇄의 2개의 3' 말단 뉴클레오타이드 각각은 2'-데옥시-피
리미딘이다. 보다 바람직하게, 2'데옥시-피리미딘은 2' 데옥시-티미딘이다.
제5 하부 측면에 따른 핵산의 추가의 양태에서, 제1 쇄의 5' 말단은 포스페이트 그룹을 포함한다.<155>
특히, 본 발명에 따른 핵산의 제5 하부 측면의 하나의 양태에서, 본 발명의 siNA 분자는 변형된 뉴클레오타이드<156>
를 포함하고 RNAi를 매개하는 능력을 보유하고 있다. 변형된 뉴클레오타이드는 안정성, 활성 및/또는 생물유용
성과 같은 시험관내 또는 생체내 특성을 개선시키는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 siNA 분자는
siNA 분자에 존재하는 뉴클레오타이드 총수의 %로서 변형된 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 이와 같이, 본
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발명의 siNA 분자는 일반적으로 약 5 % 내지 약 100 %의 변형된 뉴클레오타이드 (예를 들어, 5 %, 10 %, 15 %,
20 %, 25 %, 30 %, 35 %, 40 %, 45 %, 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % 또는
100 % 변형된 뉴클레오타이드)를 포함할 수 있다. 주어진 siNA 분자중에 존재하는 변형된 뉴클레오타이드의 실
제 %는 siNA에 존재하는 뉴클레오타이드 총수에 의존할 것이다. siNA 분자가 일본쇄인 경우, % 변형은 일본쇄
siNA 분자중에 존재하는 뉴클레오타이드 총수를 기준으로 할 수 있다. 또한, siNA 분자가 이본쇄인 경우, % 변
형은 센스 쇄, 안티센스 쇄 또는 센스 및 안티센스 쇄 둘다에 존재하는 뉴클레오타이드 총수를 기준으로 할 수
있다.
비제한적인 예에서, 화학적으로 변형된 뉴클레오타이드의 특히 본 발명에 따른 핵산의 제5 하부 측면의 핵산분<157>
자로의 도입은 외부로 전달되는 본래 RNA 분자에 고유적인 생체내 안정성 및 생물유용성의 잠재적인 한계를 극
복하는데 있어서 강력한 도구를 제공한다. 예를 들어, 화학적으로 합성된 핵산 분자의 사용은 화학적으로 변형
된 핵산 분자가 혈청에서 보다 긴 반감기를 갖는 경향이 있기 때문에 주어진 치료 효과를 위한 특정핵산 분자의
용량을 저하시킬 수 있다. 추가로, 특정 화학적 변형은 특정 세포 또는 조지을 표적화함에 의해 및/또는 핵산
분자의 세포 취득을 개선시킴에 의해 핵산 분자의 생물유용성을 개선시킬 수 있다. 따라서, 심지어 화학적으로
변형된 핵산 분자의 활성이 본래의 핵산 분자와 비교하여 감소되더라도 예를 들어, 모든 RNA 핵산 분자와 비교
하는 경우, 변형된 핵산 분자의 총 활성은 분자의 개선된 안정성 및/또는 전달로 인해 고유 분자 보다 더 클 수
있다. 고유 비변형된 siNA와 같지 않게 화학적으로 변형된 siNA는 또한 사람에서 인터페론 활성을 활성화시킬
가능성을 최소화시킬 수 있다.
바람직하게, 본 발명에 따른 핵산의 제5 하부 측면과 관련하여, 본 발명의 siNA 분자의 안티센스 쇄, 즉 제1 쇄<158>
는 당해 안티센스 영역의 3' 말단에서 포스포로티오에이트 상호뉴클레오타이드 연결을 포함할 수 있다. 안티센
스 쇄는 당해 안티센스 영역의 5' 말단에서 약 1개 내지 약 5개의 포스포로티오에이트 상호인터뉴클레오타이드
연결을 포함할 수 있다. 본 발명의 siNA 분자의 3' 말단 뉴클레오타이드 오버행은 핵산 당, 염기 또는 산 당,
염기 또는 골격에서 화학적으로 변형된 리보뉴클레오타이드 또는 데옥시리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
3' 말단 뉴클레오타이드 오버행은 하나 이상의 범용 염기 리보뉴클레오타이드를 포함할 수 있다. 3'-말단 뉴클
레오타이드 오버행은 하나 이상의 비사이클릭 뉴클레오타이드를 포함할 수 있다.
특히, 뉴클레오타이드로 이루어진 루프를 포함하는 본 발명의 양태가 벡터에 의해 사용되고 발현되기에 적합한<159>
것임을 당업자는 인지할 것이다. 바람직하게, 당해 벡터는 발현 벡터이다. 당해 발현 벡터는 특히 임의의 유
전자 치료 방법에서 유용하다. 따라서, 당해 벡터는 본원에 기재된 질환의 치료에 사용되기에 바람직할 수 있
는 약제의 제조를 위해 사용될 수 있다. 그러나 또한 임의의 비천연적으로 존재하는 변형을 포함하는 본 발명
에 따른 핵산의 임의의 양태가 벡터 및 세포, 조직, 기관 및 유기체와 같은 벡터용 발현계에서 발현시키기 위해
즉각적으로 사용될 수 없음을 당업자는 인지할 것이다. 그러나, 본 발명에서 당해 변형이 벡터에 의한 핵산 분
석 발현 후 본 발명에 따른 벡터 유래되거나 벡터 발현된 핵산으로 첨가되거나 도입될 수 있다. 특히 바람직한
벡터는 플라스미드 벡터 또는 바이러스 벡터이다. 발현 벡터에서 siRNA 분자 및 RNAi 분자를 사용하는 방법에
관한 기술적 교시는 예를 들어, 국제 특허원 제WO01/70949호에 기재되어 있다. 당해 벡터가, 바람직하게 본 발
명에 따른 핵산의 지연된 존재가 각각 요망되고 유용한 치료학적 또는 진단학적 임의의 방법에서 유용한 반면
본 발명에 따른 비벡터 핵산 및 특히 본 발명에 따른 화학적으로 변형되거나 화학적으로 합성된 핵산은 특히 분
자의 일시적 존재가 요망되거나 유용한 경에 유용함을 당업자는 인지할 것이다.
본원에 기재된 핵산 분자의 합성을 위한 방법은 당업자에게 공지되어 있다. 당해 방법은 무엇보다 문헌[참조:<160>
Caruthers et al, 1992, Methods in Enzymology 211, 3-19, Thompson et al, International PCT Publication
No. WO 99/54459, Wincott et al, 1995, Nucleic Acids Res. 23, 2677-2684, Wincott et al, 1997, Methods
MoI. Bio., IA, 59, Brennan et al, 1998, Biotechnol Bioeng., 61, 33-45, and Brennan, U.S. Pat. No.
6,001,311]에 기재되어 있다. 이들 문헌 모두는 본원에서 참조로서 인용된다.
추가의 측면에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 지질복합체에 관한 것이다. 당해 지질복합체는 하<161>
나 또는 수개의 핵산 분자 및 하나 또는 수개의 리포좀으로 이루어진다. 바람직한 양태에서, 지질복합체는 하
나의 리포좀 및 수개의 핵산 분자로 이루어진다.
지질복합체는 다음과 같이 특징 분석될 수 있다. 본 발명에 따른 지질복합체는 약 40 내지 55 mV, 바람직하게<162>
는 약 45 내지 50 mV의 제타-전위를 갖는다. 본 발명에 따른 지질복합체의 크기는 역학적 광 산란(QELS), 예를
들어, N5 서브마이크론 입자 크기 분석기(제조원: Beckman Coulter)를 사용함에 의해 제조업자의 지침에 따라
측정시 약 80 내지 200 nm이고, 바람직하게는 약 100 내지 140 nm이고 보다 바람직하게는 약 110 nm 내지 130
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nm이다.
본 발명에 따른 지질복합체의 일부를 형성하는 리포좀은 바람직하게 <163>
a) 약 50 mol%의 β-아르기닐-2,3-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드, 바람<164>
직하게 β-(L-아르기닐)-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸-N-올레일-아미드 트리하이드로클로라이드,
b) 약 48 내지 49 mol%의 l,2-디피타노일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE), 및 <165>
c) 약 1 내지 2 mol%의 l,2-디스테아로일-sn-글리세로-S-포스포에탄올아민-폴리에틸렌- 글리콜, 바람직하게 N-<166>
(카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-1,2-디스테아릴-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염으로 이루어
진 양전하 리포좀이다.
리포좀을 형성하는 지질복합체 및 지질 조성물은 바람직하게 담체에 포함된다. 그러나, 지질복합체는 또한 동<167>
결건조된 형태로 존재할 수 있다. 담체중에 포함된 지질 조성물은 일반적으로 분산제를 형성한다. 보다 바람
직하게, 당해 담체는 본원에서 추가로 특징 분석된 바와 같은 수성 매질 또는 수성 용제이다. 지질 조성물은 전
형적으로 담체중에서 리포좀을 형성하고, 이때, 당해 리포좀은 바람직하게 또한 내부에 담체를 함유한다.
담체중에 함유된 지질 조성물 및 담체는 각각 바람직하게 약 50 내지 600 mosmole/kg, 바람직하게는 약 250 내<168>
지 350 mosmole/kg, 및 보다 바람직하게는 약 280 내지 320 mosmole/kg의 몰삼투압농도를 갖는다.
제1 지질 성분에 의해 형성되고 임의로 또한 바람직하게는 제1 지질 성분과 배합된 제1 헬퍼 지질에 의해 바람<169>
직하게 형성된 당해 리포좀은 바람직하게 약 20 내지 200nm, 바람직하게는 약 30 내지 100nm 및 보다 바람직하
게는 약 40 내지 80nm의 입자 크기를 나타낸다.
추가로, 이것은 입자 크기가 특정 통계적 분포로 존재하는 것으로 인지된다.<170>
본 발명과 관련된 지질 조성물의 추가의 임의의 특징은 담체의 pH가 바람직하게 약 4.0 내지 6.0이라는 것이다.<171>
그러나 4.5 내지 8.0, 바람직하게는 약 5.5 내지 7.5, 보다 바람직하게는 약 6.0 내지 7.0과 같은 다른 pH 범
위가 본 발명에 속한다.
이들 특정 특징들을 확인하기 위해 다양한 측정이 취해질 수 있다. 몰삼투압농도를 조정하기 위해 예를 들어,<172>
당 또는 당 배합물이 특히 유용하다. 따라서 본 발명의 지질 조성물은 하나 또는 수개의 하기 당을 포함할 수
있다: 슈크로스, 트레할로스, 글루코스, 갈락토스, 만노스, 말토스, 락툴로스, 이눌린 및 라피노스. 여기서 슈
크로스, 트레할로스, 이눌린 및 라피노스가 특히 바람직하다. 특히 바람직한 양태에서, 몰삼투압농도는 대부분
당 첨가에 의해 조정되고 약 300 mosmole/kg이고 이는 270 mM의 슈크로스 용액 또는 280 mM의 글루코스 용액
에 상응한다. 바람직하게 당해 담체는 당해 지질 조성물이 투여되어야만 하는 체액과 등장성이다. 본원에 사
용된 바와 같이 몰삼투압농도는 대부분 당 첨가에 의해 조정된다는 용어는 약 80% 이상, 바람직하게는 약 90%
이상의 몰삼투압농도가 당 또는 당의 배합물에 의해 제공됨을 의미한다.
본 발명의 지질 조성물의 pH가 조정되는 경우 이것은 기본적으로 당업자에게 공지된 완충 물질을 사용함에 의해<173>
수행된다. 바람직하게, 양이온성 지질의 염기성 특성 및 양이온성 헤드 그룹의 암모늄 그룹의 염기성 특성을
보정하기 위해 적합한 염기성 물질이 사용된다. 염기성 아미노산 및 약염기와 같은 염기성 물질을 각각 첨가하
는 경우, 상기 몰삼투압농도가 고려되어야만 한다. 당해 지질 조성물 및 당해 지질 조성물에 의해 형성된 리포
좀의 입자 크기는 바람직하게 역학적 광 산란, 예를 들어, N5 서브마이크론 입자 크기 분석기[제조원: Beckman
Coulter]를 제조업자의 지침에 따라 사용함에 의해 측정된다.
지질 조성물이 하나 또는 수개의 핵산을 포함하는 경우, 당해 지질 조성물은 일반적으로 지질복합체, 즉 리포좀<174>
과 핵산으로 이루어진 복합체를 형성한다. 바람직하게 등장성 270 mM 슈크로스 또는 280 mM 글루코스중의 지질
복합체중에 전체 지질 함량의 보다 바람직한 농도는 약 0,01 내지 100 mg/ml, 바람직하게는 0.01 내지 40 mg/ml
이고 보다 더 바람직하게는 0.01 내지 25 mg/ml이다. 당해 농도는 전형적으로 2 내지 3 인자 정도로 합당한 스
톡을 제조하기 위해 증가될 수 있는 것으로 인지되어야만 한다. 또한 본 발명에서 이를 기준으로 희석액이 제
조되고, 이때 당해 희석액은 전형적으로 몰삼투압농도가 상기 특정된 범위내에 있도록 제조된다. 보다 바람직
하게, 당해 희석액은 동일한 담체중에서 제조되거나 지질 조성물과 연계하여 사용된 담체 또는 지질 조성물이
함유된 담체와 유사한 기능 및 보다 구체적으로 유사한 몰삼투압농도 측면에서 제조된다. 또한 핵산, 바람직하
게는 기능성 핵산, 예를 들어, siRNA(이에 제한되지 않음)을 포함하는 본 발명의 지질 조성물의 양태에서, 지질
조성물중의 기능성 핵산, 바람직하게는 siRNA의 농도는 약 0.2 내지 0.4mg/ml, 바람직하게는 0.28 mg/ml이고,
총 지질 조성물은 약 1.5 내지 2.7 mg/ml, 바람직하게는 2.17 mg/ml이다. 핵산 분획물과 지질 분획물간의 당해
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질량 비율은 또한 이어서 실현될 전하 비율과 관련하여 특히 바람직한 것으로 인지되어야만 한다. 본 발명의
지질 조성물의 임의의 추가의 농도 또는 희석과 관련하여 당해 특정 양태에서 질량 비 및 전하 비 각각은 바람
직하게 당해 농도 또는 희석에도 불구하고 유지되는 것이 바람직하다.
예를 들어, 약제학적 조성물중에 사용된 바와 같은 당해 농도는 본원에 기재된 적합한 양의 매질, 바람직하게는<175>
생리학적으로 허용되는 완충액 또는 임의의 담체중에 지질을 분산시킴에 의해 수득될 수 있거나 적당한 수단에
의해 농축될 수 있다. 당해 적당한 수단은 예를 들어, 가교 유동 한외 여과를 포함하는 한외 여과방법이다.
여과기 막은 1.000 내지 300.000 Da 분자량 컷-오프(MWCO)를 갖는 공극 폭 또는 5 nm 내지 1 μm의 공극 폭을
나타낼 수 있다. 특히 약 10.000 내지 100.000 Da MWCO의 공극 폭이 바람직하다. 지질 조성물, 보다 구체적으
로 본 발명과 관련된 지질 복합체가 동결건조된 형태로 존재할 수 있음을 당업자는 인지할 것이다. 당해 동결
건조된 형태는 전형적으로 지질복합체의 저장 수명을 증가시키는데 적합하다. 무엇보다 적당한 몰삼투압농도를
수득하기 위해 첨가된 당은 동결 보호제로서 함께 사용된다. 이와 관련하여 지질복합체 농도 뿐만 아니라 몰삼
투압농도 또는 pH의 상기된 특징은 담체중에 용해되거나 현탁되거나 분산된 형태의 지질 조성물을 언급하는 것
으로 인지되어야만 하고 당해 담체는 원칙적으로 본원에 기재된 임의의 담체 및 전형적으로 수성 담체, 예를 들
어, 물 또는 생리학적으로 허용되는 완충액, 바람직하게는 등장성 완충액 또는 등장성 용액이다.
이들 특정 제형외에도 본 발명에 따른 핵산 분자는 또한 당업계에 공지된 바와 같은 약제학적 조성물중에 제형<176>
화될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 핵산 분자는 바람직하게, 단독으로 또는 기타 치료제와 병용하여 약물 및 진단제로서<177>
사용하기에 적합할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 핵산 분자는 피검체에게 투여하기 위한 리포좀, 담체
및 희석제 및 이의 염를 포함하는 전달 비히클을 포함할 수 있고/있거나 약제학적으로 허용되는 제형중에 존재
할 수 있다. 핵산 분자의 전달 방법은 문헌[참조: Akhtar et al., 1992, Trends Cell Bio., 2, 139; Delivery
Strategies for Antisense Oligonucleotide Therapeutics, ed. Akhtar, 1995, Maurer et al., 1999, MoI.
Memb. Biol., 16, 129-140; Hofland and Huang, 1999, Handb. Exp. Pharmacol, 137, 165-192; and Lee et
al., 2000, ACS Symp. Ser., 752, 184-192; 이 문헌은 참조로서 본원에 인용된다]에 기재되어 있다. 문헌[참
조: Beigehnan et al., U.S. Pat. No. 6,395,713 and Sullivan et al., PCT WO 94/02595]은 추가로 핵산 분자
의 전달을 위한 일반적인 방법을 기재하고 있다. 이들 프로토콜은 실질적으로 임의의 핵산 분자의 전달을 위해
사용될 수 있다. 핵산 분자는 당업자에게 공지된 다양한 방법에 의해 세포로 투여될 수 있고 이러한 방법에는
리포좀중의 캅셀화, 이온영동 또는 기타 비히클(예를 들어, 하이드로겔, 사이클로덱스트린(문헌참조: Gonzalez
et al., 1999, Bioconjugate Chem., 10, 1068-1074), 생분해성 나노캅셀 및 생접착성 미소구)로의 혼입 또는
단백질성 벡터(문헌참조: O'Hare and Normand, International PCT Publication No. WO 00/53722)에 의한 방법
을 포함하지만 이에 제한되지 않는다. 또한, 핵산/비히클 배합은 직접 주사 또는 주입 펌프의 사용으로 국소적
으로 전달된다. 본 발명의 핵산 분자의 직접적인 주사는 피하, 근육내, 또는 피내이든 상관없이 표준 바늘 및
주사기 방법을 사용하여 수행할 수 있거나 바늘 부재 기술, 예를 들어, 문헌[참조: Conry et al., 1999, Clin.
Cancer Res., 5, 2330-2337 and Barry et al., International PCT Publication No. WO 99/31262]에 기재된 것
들에 의해 수행될 수 있다. 본 발명의 분자는 약제로서 사용될 수 있다. 바람직하게, 약제는 피검체의 질환
상태의 발병을 예방하고 조절하거나 치료(증상을 어느 정도, 바람직하게는 모든 증상을 완화시키는)한다.
따라서, 안정화제, 완충제등과 같은 허용되는 담체중에 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산을 포함하는 약제학적<178>
조성물이 제공된다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 또는 핵산이 투여될 수 있고(예를 들어, RNA, DNA 또는 단
백질) 안정화제, 완충액등의 존재 또는 부재하에 임의의 표준 수단에 의해 피검체에 도입되어 약제학적 조성물
을 형성할 수 있다. 리포좀 전달 기작을 사용하는 것이 바람직한 경우, 리포좀 형성을 위한 표준 프로토콜이
수행될 수 있다. 본 발명의 조성물은 또한 경구투여용으로 정제, 캅셀제 또는 엘릭시르제, 직장 투여용으로의
좌제, 주사 투여용으로의 멸균 용액, 현탁제 및 당업계에 공지된 기타 조성물로 제형화되고 사용될 수 있다.
추가로 본 발명에 따른 핵산 분자의 약제학적으로 허용되는 제형이 제공된다. 이들 제형은 상기 화합물의 염,<179>
예를 들어, 산 부가염, 예를 들어, 염산염, 브롬산염, 아세트산염 및 벤젠 설폰산염을 포함한다.
약리학적 조성물 또는 제형은 바람직하게 예를 들어, 세포 또는 사람을 포함하는 피검체에 투여용, 예를 들어,<180>
전신 투여용으로 적합한 형태의 조성물 또는 제형을 언급한다. 적합한 형태는 부분적으로 용도 또는 진입 경로,
예를 들어, 경구, 경피 또는 주사와 같은 진입 경로에 따라 다양하다. 당해 형태는 조성물 또는 제형이 표적 세
포(즉, 음전하 핵산이 전달될 필요가 있는 세포)에 도달하는 것을 방해하지 말아야 한다. 예를 들어, 혈류로
주사된 약리학적 조성물은 용해성이어야만 한다. 기타 인자는 당업계에 공지되어 있고 독성 및 조성물 또는 제
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형이 이의 효과를 발휘하는 것을 방해하는 형태와 같은 고려를 포함한다.
"전신 투여"란 혈류중 약물의 생체내 흡수 또는 축적에 이어서 전신에 걸쳐 분포되도록 함을 의미한다. 전신<181>
흡수를 유도하는 투여 경로는 제한없이 정맥내, 피하, 복강내, 흡입, 경구, 폐내 및 근육내를 포함한다. 이들
투여 경로 각각은 본 발명의 siNA 분자 또는 siRNA 분자들을 접근가능한 환부 조직에 노출시킨다. 본 발명의
핵산 분자와 같은 약물의 혈류로의 진입 비율은 분자량 또는 크기의 함수인 것으로 밝혀졌다. 본 발명에 따른
핵산을 포함하는 리포좀 또는 기타 약물 담체의 사용은 잠재적으로 예를 들어, 특정 조직 유형, 예를 들어, 신
생물 조직에 약물을 위치시킬 수 있다. 림프구 및 마크로파아지와 같은 세포 표면과 약물의 연합을 촉진시킬
수 있는 리포좀 제형이 또한 유용하다. 당해 방법은 신생물 조직을 형성하는 세포와 같은 비정상적인 세포에
대한 마크로파아지 및 림프구 면역 인지의 특이성을 이용함에 의해 표적 세포로 약물을 전달할 수 있다.
"약제학적으로 허용되는 제형"이란 바람직하게 본 발명에 따른 핵산 분자가 이의 목적하는 활성을 위해 적합한<182>
물리적 위치에 효과적으로 분포시킴을 허용하는 조성물 또는 제형을 의미한다. 본 발명에 따른 핵산 분자와의
제형화를 위해 적합한 제제에 대한 비제한적인 예는 다음을 포함한다: 약물의 CNS로의 진입을 증진시킬 수 있는
P-당단백질 억제제(예를 들어 Pluronic P85)(문헌참조: Jollict-Riant and Tillement, 1999, Fundam. Clin.
Pharmacol., 13, 16-26); 생물분해성 중합체, 예를 들어, 뇌내 이식 후 지연 방출 전달을 위한 폴리(DL-락티드-
코-글리콜리드) 미소구[문헌참조: (Emerich, DF et al., 1999, Cell Transplant, 8, 47-58) (Alkermes, Inc.
Cambridge, MA)]; 및 혈내장벽을 거쳐 약물을 전달시켜 신경원 취득 기작을 변화시킬 수 있는 폴리부틸시아노아
크릴레이트로 이루어진 것들과 같은 로딩된 나노입자(문헌참조: Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry,
23, 941-949, 1999). 본 발명의 핵산 분자에 대한 전달 전략의 비제한적인 예는 문헌[참조: Boado et al.,
1998, J. Pharm. ScL, 87, 1308-1315; Tyler et al., 1999, FEBS Lett., 421, 280-284; pardridge et al.,
1995, PNAS USA., 92,5592-5596; Boado, 1995, Adv. Drug Delivery Rev., 15,73-107; Aldrian-Herrada et
al., 1998, Nucleic Acids Res., 26, 4910-4916; and Tyler et al., 1999, PNAS USA., 96, 7053-7058]에 기재
된 물질을 포함한다.
또한 폴리(에틸렌 글리콜) 지질을 포함하는 표면 개질 리포좀(PEG-변형되거나 긴 환형 리포좀 또는 스텔쓰 리포<183>
좀)을 포함하는 조성물의 용도가 제공된다. 이들 제형은 표적 조직에서 약물의 축적을 증가시키는 방법을 제공
한다. 이러한 부류의 약물 담체는 단핵 식세포 시스템(MPS 또는 RES)에 의한 옵소닌 작용 및 제거에 대해 내성
을 가짐으로써 혈액 순환 시간을 보다 길게하고 캅셀화된 약물에 대한 조직 노출을 증가시킬 수 있다(문헌참조:
Lasic et al. Chem. Rev. 1995, 95, 2601-2627; Ishiwata et al., Chem. Pharm. Bull. 1995, 43, 1005-1011).
당해 리포좀은 종양에서, 추정컨대 신생혈관 형성 표적 조직에서 혈관외 유출 및 포획에 의해 선택적으로 축적
하는 것으로 밝혀졌다(문헌참조: Lasic et al., Science 1995, 267, 1275-1276; Oku et al., 1995, Biochim.
Biophys. Acta, 1238, 86-90). 긴 순환 리포좀은 특히 MPS의 조직에서 추적하는 것으로 공지된 통상적인 양이
온성 리포좀에 비해 DNA 및 RNA의 약제 역학적 작용 및 약리 역학적 작용을 증진시킨다(문헌참조: Liu et al.,
J. Biol. Chem. 1995,42,24864-24780; Choi et al., Internaional PCT Publication No. WO 96/10391; Ansell
et al., International PCT Publication No. WO 96/10390; Holland et al., International PCT Publication
No. WO 96/10392). 긴 순환 리포좀은 또한 간 및 비장과 같은 대사적으로 공격적인 MPS 조직에서의 축적을 회
피하기 위한 이들의 능력을 기초로 양이온성 리포좀에 비해 보다 큰 정도로 뉴클레아제 분해로부터 약물을 보호
할 가능성이 있다.
더욱이, 약제학적으로 허용되는 담체 또는 희석제중에서 본 발명에 따른 핵산 분자와 같은 약제학적 유효량의<184>
목적하는 화합물을 포함하는 투여 저장용으로 제조된 조성물이 본원에서 제공된다. 치료학적 사용을 위해 허용
되는 담체 또는 희석제는 약제 기술분야에서 널리 공지되어 있고 예를 들어, 본원에 참조로서 인용되는 문헌[참
조: Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985)]에 기재되어 있
다. 예를 들어, 방부제, 안정화제, 약물 및 향제가 제공될 수 있다. 이들은 나트륨 벤조에이트, 소르브산 및
p-하이드록시벤조산의 에스테르를 포함한다. 또한, 산화방지제 및 현탁제가 사용될 수 있다.
약제학적 유효량은 질환 상태의 발병을 예방하거나 억제하거나 치료(어느 정도 증상을 완화시키거나 바람직하게<185>
는 증상 모두를 완화시키는)하기 위해 요구되는 양이다. 약제학적 유효량은 질환 유형, 사용되는 조성물, 투여
경로, 치료될 포유동물의 유형, 고려중에 있는 특정 포유동물의 신체적 특성 및 당업자가 인지할 기타 인자에
의존한다. 일반적으로, 활성 성분의 0.1 mg/kg 내지 100 mg/kg 채중/하루의 양은 음전하 중합체의 효능에 따라
투여된다.
본 발명에 따른 핵산 분자 및 이의 제형은 경구적으로, 국소적으로, 비경구적으로, 흡입 또는 분무에 의해 또는<186>
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직장으로 통상적인 비독성의 약제학적으로 허용되는 담체, 보조제 및/또는 비히클을 함유하는 투여 단위 제형으
로 투여될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 비경구는 경피, 피하, 혈관내(예를 들어, 정맥내), 근육내
또는 협막내 주사 또는 주입 기술등을 포함한다. 또한, 본 발명의 핵산 분자 및 약제학적으로 허용되는 담체를
포함하는 약제학적 제형이 제공된다. 본 발명에 따른 하나 이상의 핵산 분자는 하나 이상의 비독성의 약제학적
으로 허용되는 담체 및/또는 희석제 및/또는 보조제 및 경우에 따라 기타 활성 성분과 연합하여 존재할 수
있다. 본 발명에 따른 핵산 분자를 함유하는 약제학적 조성물은 경구용으로 적합한 형태, 예를 들어, 정제, 트
로키제, 로젠지제, 수성 또는 유성 현탁제, 분산성 산제 또는 입제, 경질 또는 연질 캅셀제 또는 시럽 또는 엘
릭시르제로서 존재할 수 있다.
경구용으로 의도된 조성물은 약제학적 조성물을 제조하기 위해 당업자에게 공지된 임의의 방법에 따라 제조될<187>
수 있고 당해 조성물은 하나 이상의 감미제, 향제, 착색제 또는 방부제를 함유하여 약제학적으로 세련되고 맛난
제제가 될 수 있다. 정제는 정제의 제조용으로 적합한 비독성의 약제학적으로 허용되는 부형제와 혼합된 활성
성분을 함유한다. 당해 부형제는 예를 들어, 불활성 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 탄산나트륨, 락토스, 인산
칼슘 또는 인산나트륨; 과립화제 및 붕해제, 예를 들어, 옥수수 전분 또는 알긴산; 결합제, 예를 들어, 전분,
젤라틴 또는 아카시아; 및 윤활제, 예를 들어, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 또는 탈크일 수 있다. 정제
는 피복되지 않을 수 있거나 이들은 공지된 기술에 의해 피복될 수 있다. 몇몇 경우에 당해 피복은 공지된 기술
에 의해 수행되어 위장관에서의 nd해 및 흡수를 지연시킬 수 있고 이로써 장기간 동안의 지연된 작용을 제공한
다. 예를 들어, 글리세릴 모노스테아레이트 또는 글리세릴 디스테아레이트와 같은 시간 지연 물질이 사용될 수
있다.
경구용 제제는 또한 경질 젤라틴(이때 활성 성분은 불활성 고체 희석제, 예를 들어, 탄산칼슘, 인산칼슘 또는<188>
카올린과 혼합된다), 또는 연질 젤라틴 캅셀제(이때 활성 성분은 물 또는 오일 매질, 예를 들어, 땅콩유, 액체
파라핀 또는 올리브유와 혼합된다)로서 제공될 수 있다.
수성 현탁제는 수성 현탁제 제조용으로 적합한 부형제와 혼합된 본 발명에 따른 핵산과 같은 활성 성분을 함유<189>
한다. 당해 부형제는 현탁제, 예를 들어, 나트륨 카복시메틸셀룰로스, 메틸셀룰로스, 하이드로프로필메틸셀룰
로스, 나트륨 알기네이트, 폴리비닐피롤리돈, 고무 트라가칸트 및 아카시아 고무이고; 분산제 또는 습윤제는 천
연의 포스파티드, 예를 들어, 렉시틴, 또는 지방산과 알킬렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌
스테아레이트, 또는 장쇄 지방족 알콜과 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어,
헵타데카에틸렌옥시옥탄올, 또는 지방산 및 헥시톨(예를 들어, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 모노올레에이트)로부터
유래된 부분적 에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 또는 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 부분적
에스테르와 에틸렌 옥사이드의 축합 생성물, 예를 들어, 폴리에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 수성
현탁제는 또한 하나 이상의 방부제, 예를 들어, 에틸, 또는 n-프로필 p-하이드록시벤조에이트, 하나 이상의 착
색제, 하나 이상의 향제 및 하나 이상의 감미제, 예를 들어, 슈크로스 또는 사카린을 함유할 수 있다.
유성 현탁제는 식물성 오일, 예를 들어, 아라키스 오일, 올리브유, 참깨유 또는 코코넛유중에 또는 액체 파라핀<190>
과 같은 광유중에 활성 성분을 현탁시킴에 의해 제형화될 수 있다. 유성 현탁제는 증점제, 예를 들어, 밀랍,
경질 파라핀 또는 세틸 알콜을 함유할 수 있다. 감미제 및 향제는 맛난 경구 제제를 제공하기 위해 첨가될 수
있다. 당해 조성물은 아스코르브산과 같은 산화방지제를 첨가하여 보존될 수 있다.
물 첨가에 의한 수성 현탁제의 제조에 적합한 분산성 산제 및 입제는 분산제 또는 습윤제, 현탁제 및 하나 이상<191>
의 방부제와 혼합된 활성 성분을 제공한다. 적합한 분산제 또는 습윤제 또는 현탁제는 이미 상기 언급된 것들
로 예시된다. 추가의 부형제, 예를 들어, 감미제, 향제 및 착색제가 또한 존재할 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 또한 수중유 에멀젼 형태일 수 있다. 유성상은 식물성 오일 또는 광유 또는 이의<192>
혼합물일 수 있다. 적합한 유화제는 천연 고무, 예를 들어, 아카시아 고무 또는 고무 트라가칸트, 천연 포스파
티드, 예를 들어, 대두콩, 렉시틴 및 지방산 및 헥시톨 무수물로부터 유래된 에스테르 또는 부분적 에스테르,
예를 들어, 소르비탄 모노올레에이트 및 에틸렌 옥사이드와 당해 부분적 에스테르의 축합 생성물, 예를 들어,
폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레에이트일 수 있다. 에멀젼은 또한 감미제 및 향제를 함유할 수 있다.
시럽 및 엘릭시르제는 감미제, 예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 소르비톨, 글루코스 또는 슈크로스와 함<193>
께 제형화될 수 있다. 당해 제제는 또한 완화제, 방부제 및 향제 및 착색제를 함유할 수 있다. 약제학적 조성물
은 멸균 주사용 수성 또는 유성 현탁제 형태일 수 있다. 당해 현탁제는 상기 언급된 적합한 분산제 또는 습윤제
및 현탁제를 사용하여 공지된 기술에 따라 제형화될 수 있다. 멸균 주사용 제제는 또한 비독성의 비경구용으로
허용되는 희석제 또는 용매중의 멸균 용제 또는 현탁제, 예를 들어, 1,3-부탄디올중의 용제일 수 있다. 사용될
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수 있는 허용되는 비히클 및 용매중에는 물, 링커액 및 등장성 염화나트륨 용액이 있다. 또한, 멸균의 비휘발
성 오일은 통상적으로 용매 또는 현탁 매질로서 사용된다. 이러한 목적을 위해, 합성 모노- 또는 디글리세라이
드를 포함하는 임의의 블랜드 비휘발성 오일을 사용할 수 있다. 추가로, 올레산과 같은 지방산은 주사제의 제
조에 사용된다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 좌제 형태로, 예를 들어, 약물의 직장 투여용으로 투여될 수 있다. 이들 조성물은<194>
실온에서 고체이지만 직장 온도에서는 액체이여서 직장에서 녹아 약물을 방출시키는 비자극성 부형제와 함께 약
물을 혼합함에 의해 제조될 수 있다. 당해 물질은 코코아 버터 및 폴리에틸렌 글리콜을 포함한다.
본 발명의 핵산 분자는 멸균 매질에서 비경구적으로 투여될 수 있다. 사용되는 비히클 및 농도에 따라 약물은<195>
비히클중에 현탁되거나 용해될 수 있다. 유리하게, 국소 마취제, 방부제 및 완충제와 같은 보조제가 비히클중에
용해될 수 있다.
약물 및 약제학적 조성물 각각의 용량 수준은 통상적인 실험에 의해 당업자가 측정할 수 있다. <196>
임의의 특정 피검체에 대한 특정 용량 수준은 사용되는 특정 화합물의 활성, 연령, 체중, 일반 건강상태, 성별,<197>
다이어트, 투여 시간, 투여 경로 및 분비 속도, 약물 병용 및 치료중인 특정 질환의 중증도에 따라 다양하다.
본 발명에 따른 약물을 개, 고양이, 말, 소, 돼지, 염소, 양, 마우스, 랫트, 햄스터 및 기니아피그와 같은 비사<198>
람 동물에게 투여하기 위해, 당해 조성물은 바람직하게 또한 동물 사료 또는 식수에 첨가될 수 있다. 동물이
이의 음식물과 함께 치료학적 적당양의 조성물을 섭취할 수 있도록 이의 식이동물 사료 및 식수 조성물을 제형
화하는 것이 간편할 수 있다. 또한 사료 또는 식수로의 추가를 위한 예비 혼합물로서 조성물을 제공하는 것이
간편할 수 있다.
본 발명의 핵산 분자는 또한 전체 치료학적 효과를 증가시키는 기타 치료학적 화합물과 병용하여 피검체에 투여<199>
될 수 있다. 증상을 치료하기 위해 다수 화합물을 사용하여 부작용의 발생을 감소시키면서 유익한 효과를 증가
시킬 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자를 특정 세포 유형으로 투여하기에 적합한 조성물이 제공되고, 이때<200>
당해 조성물에는 전형적으로 각각 하기의 주요성분 및 분자중 하나 또는 수개가 혼입된다. 예를 들어, 아시알
로글리코단백질 수용체(ASGPr) (문헌참조: Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262, 4429-4432)는 간세포에 고유
하고 측쇄 갈락토스-말단 당단백질, 예를 들어, 아시알로오로소뮤코이드(ASOR)와 결합한다. 또 다른 예에서,
폴레이트 수용체는 많은 암 세포에서 과발현된다. 당해 당단백질, 합성 당접합체 또는 폴레이트의 수용체로의
결합은 올리고사카라이드 쇄의 측쇄화 정도에 강하게 의존하는 친화성으로 일어나고 예를 들어, 트리아테너리
구조는 바이아테너리 또는 모노테너리 쇄 보다 큰 친화성으로 결합한다(문헌참조: Baenziger and Fiete, 1980,
Cell, 22, 611-620; Connolly et al, 1982, J. Biol. Chem., 257, 939-945). 문헌[참조: Lee and Lee, 1987.
Glycoconjugate J., 4, 317-328]에서는 갈락토스에 비해 수용체 대한 보다 큰 친화성을 갖는 탄수화물 잔기로서
N-아세틸-D-갈락토스아민을 사용하여 큰 특이성을 수득하였다. 이러한 "클러스터링 효과"는 또한 만노실-말단
당단백질 또는 당접합체의 결합 및 취득을 위해 기재되었다 (문헌참조: Ponpipom et al, 1981, J. Med. Chem.,
24, 1388-1395). 외인성 화합물을 세포 막을 통해 수송하기 위한 갈락토스, 갈락토사민 또는 폴레이트 기본 접
합체의 사용은 예를 들어, 간 질환의 치료, 간암 또는 기타 암의 치료에 표적화된 전달 방법을 제공할 수 있다.
생물접합체의 사용은 또한 치료를 위해 요구되는 치료학적 화합물의 요구되는 용량을 감소시킬 수 있다. 추가
로, 치료학적 생물유용성, 약동학적 및 약역학적 계수는 발명의 핵산 생물접합체의 사용으로 조절될 수 있다.
당해 생물접합체의 비제한적인 예는 문헌[참조:Vargeese et al, USSN 10/201,394, filed August 13, 2001; and
Matulic-Adamic et al, USSN 60/362,016, filed March 6, 2002]에 기재되어 있다.
다양한 양태에서, 본 발명에 따른 핵산 분자, 벡터, 세포, 약물, 조성물 및 특히 당해 성분을 포함하는 약제학<201>
적 조성물, 당해 핵산 분자를 포함하는 본 발명에 따른 조직 및 동물 각각은 진단 및 연구 분야에서 뿐만 아니
라 치료학적 용도 둘다에서 사용될 수 있다.
하기의 질환에 관여하는 다양한 조직 및 혈관 내피에 CD1의 분포로 인해, 본 발명에 따른 핵산 분자는 당해 질<202>
환의 치료 및/또는 예방을 위해 사용될 수 있다.
따라서, 본원에 기재된 바와 같은 핵산 분자 및 이를 포함하는 약물 및 약제학적 조성물은 불충분하거나 비정상<203>
적이거나 과도한 혈관형성을 특징으로 하거나 이에 의해 유발되는 질환을 포함하는 혈관형성 촉진 및 억제 치료
를 위해 사용될 수 있다. 당해 질환은 감염성 질환, 자가면역 장애, 혈관기형, 죽상동맥경화증, 이식
동맥병증, 비만, 건선, 사마귀, 알레르기성 피부염, 지속성 증식성 초자체, 당뇨망막병증, 미성숙 망막병증, 노
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인성 황반 질환, 맥락막 혈관신생, 1차 폐 고혈압, 천식, 비강 폴립, 염증성 장 및 치주 질환, 복수, 복막
접착, 자궁내막증, 자궁 출혈, 난소 포낭, 난소암, 난소 과다자극, 관절염, 활막염, 골수염, 골증식체 형성 및
졸중, 궤양, 죽상경화증 및 류마티스 관절염을 포함한다.
추가의 질환은 신생물 조직을 특징으로 하거나 이것이 관여된 질환이다. 바람직하게 본원에서 사용된 바와<204>
같이, 용어 신생물 조직은 유기체에 의해 생성되는 조직, 생성되도록 의도되지 않고 병원성인 것으로 간주되는
(즉, 당해 각각의 질환을 앓지 않는 피검체에는 존재하지 않는) 유기체의 조직 또는 세포를 언급한다. 또한,
바람직하게 본원에 사용된 바와 같이, 신생물 질환은 직간접적으로 신생물 조직의 존재로부터 비롯되는 임의의
질환이고 여기서, 바람직하게 당해 신생물 조직은 조절불능 또는 비조절된, 바람직하게 조직의 자가 성장으로부
터 비롯된다. 용어 신생물 질환은 바람직하게 또한 악성 신생물 질환 뿐만 아니라 양성 질환을 포함한다. 보
다 바람직하게, 신생물 질환은 골암, 유방암, 전립선암, 소화기암, 결장직암, 간암, 폐암, 신장암, 생식기암,
췌장암, 뇌하수체암, 고환암, 안와암, 두경부암, 중추신경계암 및 호흡기관암중 임의의 암을 포함하는 그룹으로
부터 선택된다.
추가로, 원칙적으로, 각각 본 발명에 따른 지질 조성물 및 지질복합체를 포함하는, 본 발명에 따른 약제학적 조<205>
성물 및 약물을 사용하여 치료될 수 있는 특정 질환은 하기의 목록으로부터 취해질 수 있다: 급성 림프모구 백
혈병(성인) , 급성 림프모구 백혈병(어린이), 급성 골수 백혈병(성인), 급성 골수 백혈병(어린이), 부신피질 암
종, 부신피질 암종(어린이), AIDS- 관련 암종, AIDS-관련 림프종, 항문암, 별세포종(어린이), 소뇌별세포종(어
린이) 대뇌, 담관암, 간외부, 방광암, 방광암(어린이), 골암, 골육종/악성 섬유 조직구종, 뇌 줄기 신경교종(어
린이), 뇌 종양(성인),뇌 종양, 뇌 줄기 신경교종(어린이), 뇌 종양, 소뇌 별세포종(어린이), 뇌 종양, 소뇌 별
세포종/악성 신경교종(어린이), 뇌 종양, 뇌실막종(어린이), 뇌 종양, 속질모세포종(어린이), 뇌 종양, 천막위
초생 신경외배엽 종양(어린이), 뇌 종양, 가시 경로 및 시상하부 신경교종(어린이), 뇌 종양(어린이), 유방암,
유방암(어린이), 유방암, 수컷 기관지 선종/유암종(어린이), 버킷 림프종(Burkitt's Lymphoma), 유암 종양(어린
이), 유암 종양, 미지의 원발성의 위장 암종, 중추 신경계 림프종, 원발성 별세포종(어린이), 소뇌 별세포종/악
성 신경교종(어린이), 경부암, 만성 림프세포 백혈병, 만성 골수 백혈병, 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장
직장암(어린이), 피부 T-세포 림프종, 자궁내막암, 뇌실막종(어린이), 식도암, 식도암(어린이), 종양 에윙 계열
(Ewing's Family of Tumors), 두개외 생식세포 종양(어린이), 두 개외 생식세포 종양, 간외 담즙관 암, 눈암,
안구내 흑색종, 눈암, 망막모세포종, 담즙방광 암, 위(위) 암, 위(위) 암 (어린이), 위장 유암 종양, 생식 세포
종양, 두개외(어린이), 생식 세포 종양, 고환외, 생식 세포 종양, 난소, 임신 세포영양막 종양, 신경교종(성
인), 신경교종(어린이) 뇌 줄기, 신경교종(어린이) 대뇌 별세포종, 신경교종(어린이) 가시적 경로 및 시상하부
뇌하수체, 모발 세포 백혈병, 두경부암, 간세포(간) 암(성인)(원발성), 간세포(간)암 (어린이)(원발성), 호지킨
림프종(성인), 호지킨 림프종(어린이), 하인두암, 시상하부 및 가시적 경로 신경교종(어린이), 안구내 흑색종,
섬 세포 암종(내분비 췌장), 카포시 육종, 신장 (신장 세포) 암, 신장암(어린이), 후두암, 후두암(어린이), 백
혈병, 급성 림프모구(성인) 백혈병, 급성 림프모구(어린이) 백혈병, 급성 골수(성인) 백혈병, 급성
골수(어린이) 백혈병, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수 백혈병, 모발 세포, 입구강암, 간암(성인)(원발성), 간
암(어린이) (원발성), 폐 암, 비-소형 세포, 폐암, 소형 세포, 림프종, AIDS-관련 림프종, 버킷 림프종, 피부
T-세포 림프종, 호지킨 (성인), 림프종, 호지킨(어린이), 림프종, 비-호지킨(성인), 림프종, 비-호지킨(어린
이), 림프종, 원발성 중추 신경계, 마크로글로불린혈증, 골의 발덴스트롬악성 섬유 조직구종/골육종, 속질모세
포종(어린이), 흑색종, 흑색종, 안구내(눈), 촉각 세포 암종, 중피세포종(성인) 악성, 중피세포종(어린이), 잠
재적 원발성 다중 내분비 신생물종 증후군을 갖는 전이성 편평 경부암(어린이), 다발성 골수종/혈장 세포 신생
물, 사상균병 균상종, 골수형성이상 증후군, 골수형성이상/골수증식성 질환, 골수 백혈병, 만성, 골수 백혈병
(성인) 급성, 골수 백혈병(어린이) 급성, 골수종, 다발성, 골수증식성 장애, 만성, 비강 및 비강주위 공동암,
비강인두암, 비강인두 암(어린이), 신경모세포종, 비-호지킨 림프종(성인), 비-호지킨 림프종(어린이), 비-편평
세포 폐 암, 경구암(어린이), 경구 비강 암, 입 및 구강인두 암, 골육종/골의 악성 섬유 조직구종, 난소암(어린
이), 난소 상피암, 난소 생식 세포 종양, 난소 저 악성 잠재 종양, 췌장암, 췌장암(어린이), 췌장암, 섬 세포,
비강주위 공동 및 비강 암, 갑상선주변암, 음경암, 갈색세포종, 송과체모세포종 및 천막위 원시성 신경외피
종양(어린이), 뇌하수체 종양, 혈장 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막 폐 배종, 임신 및 유방암, 임신 및 호지
킨 림프종, 임신 및 비-호지킨 림프종, 원발성 중추 신경계 림프종, 전립선암, 직장암, 신장 세포(신장) 암, 신
장 세포(신장) 암 (어린이), 신장 골반 및 뇨관, 전이성 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종(어린이),
분비선암, 분비선암(어린이), 육종, 에윙 육종, 카포시 육종, 연조직(성인) 육종, 연조직(어린이), 육종, 자궁,
세자리 증후군(Sezary Syndrome), 피부암(비-흑색종), 피부암(어린이), 피부암(흑색종), 피부암종, 촉각 세포,
소형 세포 폐 암, 소장암, 연조직 육종(성인), 연조직 육종(어린이), 편평 세포 암종, 잠재 원발성을 갖는 편평
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경부암, 전이상 위(위)암, 위(위) 암(어린이), 천막위 원시성 신경외피 종양(어린이), T-세포 림프종, 피부 고
환 암, 흉선종(어린이),흉선종 및 흉선 암종, 갑상선 암 갑상선 암(어린이), 신장 골반 및 뇨관의 전이성 세포
암, 세포영양막 종양, 복강임신, 뇨관 및 신장 골반, 전이성 세포 암, 요도암, 자궁암, 자궁내막 자궁 육종, 질
암, 가시적 경로 및 시상하부 신경교종(어린이), 음경암, 발덴스트롬 마크로글로불린혈증, 빌름스 종양.
본 발명에 따른 약제학적 조성물이 사용될 수 있는 치료 및 예방을 위해 본원에 기재된 다양한 질환이 또한 본<206>
원에 기재된 약물이 사용될 수 있는 예방 및/또는 치료를 위한 질환이고 그 반대의 경우도 그러하다는 것이 인
지되어야만 한다.
본원에 사용된 바와 같은 용어 질환 치료는 또한 당해 질환의 예방을 포함한다.<207>
추가의 특징, 양태 및 잇점은 하기의 도면으로부터 취해질 수 있고, 여기서,<208>
도 1은 상이하게 설정된 종양의 내피 세포의 공초점 현미경 사진을 보여준다; <209>
도 2a 및 2b는 상이한 CD31 특이적 siRNA 분자(a) 및 상이한 양의 명백한 CD31 특이적 siRNA 분자(b)를 사용한<210>
녹다운 실험의 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여준다;
도 2c는 다양한 siRNA 분자의 투여 즉시 다양한 간 효소의 활성을 나타내는 다이아그램을 보여준다;<211>
도 2d는 상이한 지질복합체의 전신 투여 즉시 IFN-알파 반응을 나타내는 다이아그램을 보여준다;<212>
도 3a은 세포 챌린지 후 일수의 함수로서 2개의 상이한 종양의 용적 및 체중 각각에 대한 상이한 제제의 효과<213>
를 설명하는 다이아그램을 보여준다;
도 3b는 상이한 지질 복합체를 사용한 종양 함유 마우스에서 녹다운 실험에 대한 웨스턴 블롯 분석 결과를 보여<214>
준다;
도 3c는 상이한 지질복합체로 처리된 마우스의 종양 절개부에서 항-CD31 항체를 사용한 면역염색 결과(왼쪽 판<215>
넬) 및 상이한 지질복합체로 처리시 필드당 혈관 합계 및 혈관 수를 나타내는 다이아그램을 보여준다;
도 4a는 실험 디자인 계획을 도시한다;<216>
도 4b는 상이한 지질복합체로 처리시 각각 전립선 종양 및 림프절 전이의 용적을 보여준다. 도 4c는 상이한 지<217>
질복합체 처리시 폐 조직에서 mRNA 녹다운을 보여준다;
도 5는 표적의 녹다운을 위해 표적 특이적 23량체 siRNA 또는 표적 특이적 19량체 siRNA를 사용한 웨스턴 블롯<218>
분석의 결과를 보여준다.
실시예 1: 재료 및 방법<219>
항체<220>
본 연구에 하기의 항체를 사용하였다: 래빗 항-PTEN (Ab-2, Neomarkers), 염소 항-CD31 및 래빗 항-CD34<221>
(Santa Cruz Biotechnology), 래빗 항-인산화된 Akt (S473) (Cell Signaling Technology), 면역조직화학 특이
적 래빗 항-인산화된-Akt (S473) (Cell Signaling Technology)), 항-CD31/PECAM-1 (Santa Cruz
Biotechnology) (다르게는 냉동절개 래트 CD31에 대해서는, Pharmingen), 및 래트-모노클로날 항-CD34 (세다레
인(Cedarlane) 염소 폴리클로날).
세포 주<222>
PC-3 세포주는 기탁기관[아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection)]으로부터 수득하였고<223>
ATCC 추천에 따라 배양배하였다. 사람 간암 세포주 HuH-7은 기관[MDC, Berlin]에서 구입하였다. 발암성 Ras
V12
를
발현하는 래트 3Yl 세포는 문헌[참조: Leenders et al., 2004]에 기재된 바와 같은 유도성 Ras
V12
의 형질도입에
의해 생성하였다. 면역블롯팅을 위한 형질감염 및 단백질 추출물은 이전에 기재된 바와 같이 수행하였다(문헌참
조: Santel et al., 2006).
종양 함유 마우스에서 siRNA-Cy3 지질복합체의 전달<224>
형광 표지된 siRNA-Cy3 지질복합체를 사용한 생체내 전달 실험은 siRNA 지질복합체를 최종 용량 1.88mg/kg<225>
siRNA-Cy3 및 14.5mg/kg 지질로 200μl 용액의 단일 꼬리 정맥 주사를 통해 정맥내로 투여함에 의해
수행하였다. 주사후 4시간째에 마우스를 희생시키고 형광 획득을 포르말린 고정된 파라핀 침지 조직 절개부에
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대해 현미경으로 조사하였다.
배양 세포에 대한 조직학적 분석 및 현미경 형광 분석은 문헌[참조: Santel et al., 2006]에 기재된 바와 같이<226>
수행하였다. 조직은 즉각적으로 16시간동안 4.5 % 완충된 포르말린중에서 고정시키고 표준 프로토콜에 의해 파
라핀 절개를 위해 가공하였다. 조직 절개부는 항-CD31 또는 항-CD34로 염색하여 파라핀 절개부에서 내피 세포
를 가시화하였다. 헤마톡실린/에오신 염색(H E) 뿐만 아니라 헤마톡실린 대조 염색을 사용한 면역조직화학은
표준 프로토콜에 따라 수행하였다. 형광 표지된 siRNA의 생체내 획득 연구를 위해 파라핀 절개부에서 파라핀을
제거하고 형광현미경(Zeiss Axioplan 현미경) 또는 공초점(Zeiss LSM510 Meta) 현미경으로 조사하였다.
미세혈관 밀도(MVD)의 측정<227>
미세혈관 수는 단일 종양 절개부의 3 내지 8개의 무작위 선택된 영역에서 CD31-/CD34-양성 혈관을 계수함에 의<228>
해 측정하였다(Fox and Harris, 2004). 혈관 유니트로서 혈관 수는 형태, 분기점 및 내강 크기와 관계없이 평
가하였다(혈관 수로서 언급함). 추가로, 혈관 밀도는 Axio vision 3.0 소프트웨어(Zeiss)를 사용하여 CD31-
/CD34-양성 혈관 구조의 총 길이(총 혈관 길이로 언급함)를 측정하여 평가하였다. 당해 계수는 200 X 배율에서
Zeiss Axioplan 광 현미경을 사용하여 종양 절개부를 스캐닝함으로써 수행하였다.
종양 이종이식 실험<229>
수컷 Hsd:NMRI-nu/nu 마우스(8주된)를 본 연구에 사용하였다. 설정된 종양 이종이식체에 대한 종양 치료 실험을<230>
위해, 총 5.0 x 10
6
종양 세포/1OOμl PBS (50% 매트리겔의 존재하에 3Yl-Ras
V12
)를 피하내로 이식하였다. 종양
용적은 캘리퍼스를 사용하여 측정하였고 하기식에 따라 계산하였다: 용적=(길이 x 폭
2
)/2. 종양 치료 실험을
위해 siRNA-지질복합체 용액을 저압 저용량 꼬리 정맥 주사에 의해 정맥내로 투여하였다. 설정된 3Yl-Ras
V12
종
양 마우스에 격일로 30 g 마우스에 대해 200μl를 주사하였다(단일 용량 1.88mg/kg siRNA 및 14.5mg/kg 지질).
오르토토픽(orthotopic) 종양 모델에서 2.0 x 10
6
PC-3 세포/30μl PBS를 전신 마비하에 전립선의 좌측 후측면
돌출부에 주사하였다(문헌참조: Stephenson et al., 1992). 설정된 전립선 종양을 갖는 30g 마우스에 상기 언급
된 스톡 용액(2.17 mg/kg siRNA 및 21.6 mg/kg 지질의 용량과 동일함)300μl를 주사하였다. 수술 50일 후에
동물을 희생시키고 종양(전립선) 용적 및 지역적 전이(꼬리, 허리 및 신장 림프절 전이)를 상기 언급된 바와 같
이 측정하였다. 간내 적용을 위해 2.0 x 10
6
세포/20μl PBS를 간의 촤측 후면 돌출부로 직접 주사하여 적용하
였다. 본 연구에서 모든 동물 실험은 승인된 프로토콜 및 문헌[참조: the Landesamt fur Arbeits-,
Gesundheitsschutz und technische Sicherheit Berlin, Germany (No. G0264/99)]에 따라 수행하였다.
통계학적 분석<231>
데이터는 평균 ± s.e.m으로서 나타낸다. 차이에 대한 통계학적 유의성은 Mann-Whitney U 시험으로 측정하였다.<232>
0.05 미만의 P값은 통계학적으로 유의적인 것으로 고려되었다.
실시예 2: CD31 siRNA 분자<233>
본 연구에 사용된 siRNA 분자(AtuRNAi, 표 1 참조)는 문헌[참조: Czauderna et al., 2003a]에 기재되어 있고<234>
제조원[BioSpring (Frankfurt a. M., Germany)]에 의해 합성되었다.
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(표 1)<235>
<236>
CD31-8 as 및 CD31-8 s에 의해 형성된 이중나선, CD31-6 as 및 CD31-6 s에 의해 형성된 이중나선, CD31-1 as<237>
및 CD31-1 s에 의해 형성된 이중나선은 3'-오버행이 결핍되어 있고 이것은 양 쇄상에 2'-O-메틸 당 변형이
교대로 존재함에 의해 화학적으로 안정화되어 있고, 이때 비변형된 뉴클레오타이드가 반대 쇄상에 변형된 것과
맞대고 있다(표 1)(문헌참조: Czauderna et al., 2003a). 당해 이중나선은 또한 본원에서 CD31-8, CD31-6 및
CD31-1로서 언급되고, 이 모두는 특히 본 발명에 따른 핵산 분자의 바람직한 양태이다.
실시예 3: CD31 특이적 siRNA 분자의 지질복합체 제형<238>
신규 양이온성 지질 AtuFECTOl (β-L-아르기닐-2,3-L-디아미노프로피온산-N-팔미틸)-N- 올레일-아미드 트리하이<239>
드로클로라이드, Atugen AG), 중성 인지질 1,2-디피타노일-sn- 글리세로-3-포스포에탄올아민(DPhyPE)(Avanti
Polar Lipids Inc., Alabaster, AL) 및 폐길화된 지질 N-(카보닐-메톡시폴리에틸렌글리콜-2000)-l,2-디스테아
로일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민 나트륨 염(DSPE-PEG) (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany)을 30OmM 멸
균 RNase- 부재 슈크로스 용액중에 지질막 재수화에 의해 4.34 mg/ml의 총 지질 농도에 대해 50/40/1의 몰비로
혼합하였다. 30g 마우스에 대한 단일 정맥 주사는 1.88 mg/kg siRNA 및 14.5 mg/kg 지질의 표준 용량에서 수행
하였다.
실시예 4: 제형화된 siRNA의 종양 내피로의 전달<240>
본 실험 목적은 암 치료 간섭을 위해 제형화된 siRNA의 적용성을 분석하기 위한 것이었다. 본 목적을 위해, 실<241>
시예 2에 기재된 19-량체의 siRNA를 사용하고 당해 분자를 양이온성 리포좀과 함께 실시예 3에 기재된 바와 같
은 siRNA-지질복합체로 제형화하고 종양 치료를 위한 생체내 적용성을 상이한 종양 이종이식 모델(PC-3, HuH-7,
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3Yl- RasV12)을 사용하는 현 연구에서 시험하였다.
반응 조건은 다음과 같다. 지질복합체 siRNA-Cy3는 안일 정맥내 주사에 의한 정맥내 투여 후 종양 함유 마우스<242>
에 투여하였다. 주사 4시간 후의 종양 조직 절개부를 현미경으로 분석하였다. 당해 결과는 도 1에 나타낸다:
상이한 설정된 종양의 내피 세포는 siRNA-Cy3-지질복합체(화살표)로 표적화시켰다. 각각 종양 유형에 대한 2개
이상의 독립적인 이종이식 실험에서 5개의 절개부에서 획득을 연구하였다. 상단 열은 피하 성장한 PC-3 종양 기
원의 절개부에 대한 형광 이미지(좌측 판넬) 및 Rasv12 형질전환된 3Y1 래트 섬유아세포 종양에 ??나 형광 이미
지(중앙 판넬) 또는 간내 성장한 HuH-7 종양의 형광 이미지(우측 판넬)을 보여준다. 하단 열은 HuH-7 종양의
내피 세포에서 전달된 siRNA-Cy3 의 검출을 보여준다. 종양 내피 세포는 이의 얇은 세포질 및 뚜렷한 핵(화살
표)을 특징으로 하는 H E(헤마톡실린/에오신 염색; 좌측 판넬)에 의해 보여진다. 후속 부분은 각각 내피 세포
주의 상응하는 siRNA-Cy3 형광(적색, 중앙 판넬) 및 항-CD34 면역염색을 보여준다.
3개의 실험 종양 이종이식(2개는 피하(s.c)이고 하나는 간내(i.hep))에서, 본 발명자는 종양 혈관계에서 상당한<243>
형광 시그날을 검출하였다(도 1, 상단 판넬). 대조적으로, 주사에 의해 정맥내로 투여된 동등한 양의 비제형화
된 siRNA는 종양 혈관으로 전혀 전달되지 않았다(데이타는 나타내지 않음). 종양 혈관계의 내피층에 의한 지질
복합체 siRNA-Cy3 획득(HuH-7, I.hep.)은 내피 세포 마커인 항-CD34 항체를 사용한 대조염색에 의해 확인하였다
(도 1, 하단 판넬). 내피세포에 의한 온전한 siRNA-지질복합체의 획득은 형광 표지된 지질을 사용하여 추가로
확인하였다((Santel et al., 2006), 데이터는 나타내지 않음). 종합해 볼 때 이들 데이터는 siRNA의 양이온성
지질 기본 제형이 간 및 종양에서 혈관의 내피세포로 siRNA가 획득되도록 한다는 것을 입증한다.
실시예 5: CD31의 생체내 유전자 사일런싱 및 종양 성장에 대한 이의 효과<244>
CD31(혈소판-내피-세포 접착 분자 1 (PECAM-1))은 이의 발현이 주로 내피 세포에 국한되어 있기 때문에 생체내<245>
siRNA 매개 유전자 사일런싱을 직접적으로 입증하기 위한 적합한 표적으로서 선택되었다. 또한, 종양 성장에
대한 CD31의 기능 상실 효과를 조사하였다. 마우스 및 사람 유래 내피세포 주(HUVEC, EOMA)에서 실시예 2에 기
재된 2'-O-메틸 변형된 siRNA 분자(표 1)의 스크리닝은 여러 강력한 사람 및 마우스 특이적 CD31-siRNA 분자의
동정을 유도하였다(도 2a). 치료학적 방법을 위해 선택된 siRNA 분자는 대조군 분자로서 비관련 siRNA 서열(루
시퍼라제 특이적 siRNA
Luc
) 뿐만 아니라 특이적 siRNA 및 siRNA 를 포함했다(본 발명자는 하기 문단
에서 siRNA
CD31
을 언급할 때 siRNACD
31-8
로서 언급한다)(도 2b).
당해 결과는 도 2에 나타내고 이는 종양 혈관계에서 CD31 발현의 억제를 나타낸다: (a) 효과적인 CD31 녹다운을<246>
위해 강력한 안정화된 siRNA의 동정. HUVEC 및 쥐 EOMA 세포는 CD31(CD31-1, -2, -6, -8)을 표적화하는 4개의
상이한 사람, 마우스 특이적 siRNA 및 대조군 PTEN-siRNA로 형질감염시켰다. 특이적 단백질 녹다운은 siRNA
CD31-
8
분자의 최고 효능을 입증하는 항-CD31 및 항-PTEN을 사용한 면역블롯팅에 의해 평가하였다: (b) 시험관내 품
질 대조군 및 HUVEC에서 전신 치료를 위해 사용되는 지질복합된 siRNA의 시험관내 효능 시험. 항-CD31 항체를
사용한 면역블롯팅은 siRNA
CD31-8
의 경우에 농도 의존적 CD31의 녹다운을 밝혔지만 대조군 siRNA를 사용에서는 그
렇지 않았다. CD31의 감소는 siRNA
PTEN
대조군과는 대조적으로 Akt 인산화 상태((P*-Akt)를 모니터링함에 의해
밝혀진 바와 같이 PI -3 키나제 시그날 전달에 대해 어떠한 효과를 갖지 않는다. CD34 단백질 수준은 영향받지
않았다: (c) 최종 정맥내 치료 후 24시간 또는 72시간째에 측정된 간 효소(AST, ALT)에 대한 siRNA
PTEN
- 및
siRNA
CD31
-지질복합체 치료의 효과. 면역 적격 마우스는 하루 용량1.88mg/kg siRNA, 14.5mg/kg 지질로 6일 연속
치료하였다. 마우스(n = 7)로부터의 평균값( ±s.e.m.)을 나타낸다: (d) 전신 siRNA-지질복합체 치료는 면역
적격 마우스에서 인터페론-α 혈청 수준을 증가시키지 않는다. 수컷 C57BL/6 마우스에 폴리(I:C) 또는 지적된
siRNA-지질복합체 용액을 1회 주사하였다(상기 참조). 주사한지 24시간 후에 채혈하고 IFNα 수준을 ELISA로 측
정하였다.
요약하여, 생체내 효능 연구를 위해 사용되는 siRNA
CD31
- 및 siRNA
PTEN
-지질복합체는 생체내 실험 전에 HUVEC에서<247>
용량 의존성 형질감염 실험에서 시험하였다. 당해 siRNA-지질복합체의 기능 및 효능을 입증하는 대표적인 면역
블롯은 도 2b에 나타낸다. CD31 단백질의 녹다운은 당해 제제를 사용하여 낮은 나노몰 범위에서 siRNA
CD31
을 사
용하여 성취하였다. siRNA
CD31
매개 유전자 사일런싱의 특이성은 PTEN, 인산화된 Akt 및 CD34에 대한 조사에 의
해 입증하였다. siRNA
PTEN
을 사용한 형질감염 같지 않게, Akt의 인산화 상태는 CD31의 감소에 의해 HUVEC 세포
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공개특허 10-2009-0004984
에서 영향받지 않았다. CD34 단백질 수준은 비처리된 대조군과 비교하는 경우 2개의 지질복합체를 사용하여 변
화되지 않았다. siRNA
Luc
- 지질복합체를 사용한 처리는 2개의 표적 유전자 CD31 및 PTEN의 발현에 대해 어떠한
효과를 갖지 않았다(데이타는 나타내지 않음).
다음, 본 발명자는 상이한 하루 용량을 사용하는 마우스의 반복적인 전신 치료를 허용하는 투여 계획을 확립하<248>
였다. 상이한 총 용량은 200μl의 지질복합체 용액(단일 용량 1.88mg/kg siRNA; 14.5mg/kg 지질)을 하루마다
또는 격일로 꼬리 정맥 주사하는 투여에 의해 성취되었다. 본 발명자는 간 효소 AST(아스파르테이트 아미노트
랜스퍼라제) 및 ALT(알라닌 아미노트랜스퍼라제)(도 2c)의 수준 변화 또는 일반 건강의 총괄 지표로서의 체중의
변화(도 4a, 하단 판넬)를 모니터링함에 의해 측정되는 바와 같은 반복적인 투여 후 동물의 건강 상태에 대한
격심한 독성 효과를 관찰하지 못했다. AST 및 ALT 효소는 siRNA
PTEN
처리 그룹에서 약간 증가하는 것으로 나타
났지만, 당해 효과는 시간 경과에 따라 가역적인 것처럼 보인다. 더욱이, 폴리 (I:C)-지질복합체(폴리-이노신산
-폴리시티딜산)과는 대조적으로 3개의 상이한 siRNA-지질복합체로 처리된 동물 기원의 혈액에서 사이토킨 인터
페론-알파(IFN-알파)의 어떠한 유도도 검출되지 않았고(도 3d) 이는 siRNA-지질복합체의 적용으로 인한 비특이
적 면역 반응의 부재를 시사한다. 이를 종합하여, 당해 데이터는 siRNA-지질복합체가 격심한 비특이적 독성 부
작용없이 반복적으로 투여될 수 있음을 시사한다.
이어서, 본 발명자는 종양 성장 억제에 대한 siRNA
CD31
-지질복합체의 효능 연구에서 하루 또는 격일 정맥내 처리<249>
를 대표하는 2개의 투여 계획을 분석하였다.
실험 조건은 하기와 같다. 도 3은 siRNA
CD31
-지질복합체 처리에 의한 s.c 이종이식 종양 성장의 억제를<250>
보여준다. 설정된 PC-3 이종이식체의 성장은 지적된(표준용량 1.88mg/kg/d siRNA; 14.5mg/kg/d 지질; 화살표)
siRNA
Luc
-지질복합체(삼각형) 또는 등장성 슈크로스(굵은 원형)와는 대조적으로 siRNA
CD31
-지질복합체(다이아몬
드)로 상당히 억제되었다. 체중의 변화는 하기 상응하는 다이아그램에서 보여지는 바와 같은 처리동안에 모니
터하였다. 3Yl-RasV12 종양 이종이식체는 누드 마우스(그룹당 7마리)에서 설정하였다. 설정된 3Yl-RasV12 종
양의 성장은 siRNA
PTEN
-지질복합체(삼각형) 또는 등장성 슈크로스(굵은 원형)와 비교하는 경우 siRNA
CD31
-지질복합
체(다이아몬드)에 의해 상당히 억제되었다. 격일 치료 계획(단일 표준 용량)은 이중 화살표로 지적된다. 데이
터는 하루 종양 용적의 평균 s.e.m.을 나타낸다; 통계학적 유의성은 별표로 나타낸다. 처리 즉시 체중 변화는
하부 판넬에서 나타낸다. 도 3b는 siRNA
CD31
-지질복합체로 전신적으로 처리된 3Yl-RasV12 종양 함유 마우스에서
CD31 단백질 녹다운이 항-CD34 뿐만 아니라 항-CD31 항체 및 항-PTEN을 사용한 종양 기원의 추출물을 사용한 면
역블롯에 의해 확인됨을 보여준다. 도 3c에 도시된 바와 같이, CD31, 단백질 감소는 등장성 슈크로스,
siRNA
CD31
-지질복합체 및 siRNA
PTEN
-지질복합체로 처리된 마우스 기원의 종양 절개부에서 항-CD31 항체를 사용한
면역염색에 의해 직접 평가하였다. 연속 절개부를 각각 항-CD31 및 항-CD34 항체로 염색시켜 종양 혈관계를 가
시화하였다. CD34에 대해서는 아니지만 CD31에 대한 감소된 염색 강도가 siRNA
CD31
-지질복합체로 처리된 마우스
기원의 종양 절개부에서 관찰되었다. MVD 정량은 각각 CD31 또는 CD34 양성 혈관 수(하단 다이아그램) 및 총
길이(상단 다이아그램)을 계수함에 의해 측정하였다.
요약하여, 2개의 치료 계획은 종양 성장에 대해 명백한 억제 효과를 나타내었다. 지질복합된 siRNA
CD31
을 사용한<251>
느리게 성장하는 s.c PC-3 종양 이종이식체의 전신 처리는 siRNA
Luc
및 siRNA
PTEN
대조군과는 대조적으로 종양 성
장을 상당히 지연시켰다(도 3a, 좌측 다이아그램). 체중 측정시 평가되는 바와 같이 처리동안에 어떠한 독성
부작용이 관찰되지 않았다. 설정된 신속히 성장하는 3Yl- RasV12 s.c. 이종이식체의 성장은 지질복합된
siRNA
CD31
을 사용한 격일 i.v. 치료에 의해 또한 어떠한 독성 효과 없이 억제되었다 (도 3a, 우측 다이아그램).
관찰된 억제는 슈크로스 처리된 대조군 그룹 뿐만 아니라 siRNA
PTEN
-지질복합체와 비교하는 경우 통계학적으로 상
당히 유의적이었다. 명백하게, CD31 단백질 수준의 유의적인 감소는 대조군 마우스에서 관찰된 변화되지 않은
단백질 수준과는 대조적으로 2일 연속동안 siRNA
CD31
-지질복합체로 처리된 마우스 기원의 3Y1-종양 용해물에서 검
출되었다(도 3b). 특이성 및 동등한 로딩을 위해 시험하기 위해, 본 발명자는 당해 용해물에서 PTEN 뿐만 아
니라 또 다른 내피 세포 마커 단백질인 CD34을 병행하여 분석하였다. 추가로, CD31 발현 감소는 또한 동일계에
서, 이종이식 종양 마우스 모델에서 내피 마커 CD31 및 CD34에 대한 미세혈관 밀도(MVD)에서의 차이를 측정함에
의해 밝혀졌다. MVD 측정은 종양 혈관형성에 대한 대용 마커이고 CD31 또는 CD34 특이적 항체를 사용한 혈관의
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면역조직화학적 염색에 의해 분석하였다(문헌참조: Fox and Harris, 2004; Uzzan et al., 2004; Weidner et
al., 1991). MVD는 각각 CD31 및 CD34 항체로 면역염색 후 연속 절개부간에 비교하였다. 지질복합된 siRNA
CD31
으
로 처리된 마우스는 혈관 길이 뿐만 아니라 혈관 총수로 측정시 CD31 양성 혈관의 총양이 통계학적으로 상당히
감소하였음을 보여주었다(도 3c). CD34 특이적 항체를 사용한 염색은 또 다시 특이적 CD31 사일런싱을 보여주는
MVD의 변화를 밝히지 못했다. 2개의 대조군 그룹, siRNA
PTEN
및 처리된 등장성 슈크로스는 CD31 또는 CD34 염색
에 의한 MVD 평가에서 차이를 나타내지 않았다. 단백질 녹다운에 대한 분자 데이터와 함께 당해 결과는
siRNA
CD31
-지질복합체 처리시 CD31 발현이 상당히 감소함을 지적한다.
실시예 6: 오르토토픽 종양 모델에서 전신 투여된 siRNA
CD31
-지질복합체의 효능<252>
전신 투여된 siRNA
CD31
-지질복합체의 잠재적인 치료학적 효과는 또한 오르토토픽 PC-3 종양 이종이식을 포함하는<253>
마우스에서 조사하였다(문헌참조: Czauderna et al., 2003b; Stephenson et al., 1992). 이것은 siRNA
CD31
-지
질복합체 처리의 치료학적 잠재력을 확실히 하기 위한 사람 전립선 암에 대해 보다 임상적으로 관련있는 모델인
것처럼 보인다. 이러한 오르토토픽 종양 모델을 위해, 사람 PC-3 전립선 암 세포는 직접 마우스 전립선으로 이
식하였고 당해 마우스를 희생시키고 이식한지 50일 후에 종양 및 전이 용적에 대해 분석하였다.
실험 조건은 다음과 같다. 실험 디자인 및 처리 스케줄은 도 4a에 나타내고, 보다 구체적인 실험 디자인은 오르<254>
토토픽 PC-3 전립선 종양 및 림프절 전이 모델에서 siRNA
CD31
-지질복합체 처리 효능을 분석하기 위한 것이다.
도 4b는 지적된 siRNA-지질복합체 또는 슈크로스를 사용한 처리 후 마우스에서 전립선 PC-3 종양 및 림프절 전
이로부터의 용량 억제를 보여준다. 처리 전에 종양 및 전이 용적은 좌측(d35, 대조군)상에 나타낸다. 통계학
적 유의성은 별표로 나타낸다. 도 5c는 이후 정량 TaqMan RT-PCR에 의해 밝혀지는 바와 같이 대조군 그룹(슈크
로스, siRNA
Luc
-지질복합체)와는 대조적으로 상응하는 siRNA-지질복합체로 처리된 마우스에서 CD31 및 Tie2 mRNA
수준의 감소를 보여준다. 9마리의 마우스로부터 수득된 mRNA의 상대적 평균 양은 CD31, Tie2 및 CD34 대조군에
대해 나타낸다.
요약하여, 음성 대조군 siRNA
Luc
-지질복합체 및 siRNA
Tie2
-지질복합체는 슈크로스 대조군 그룹과 비교하는 경우,<255>
종양 및 종양 전이 용적에 있어서 약간의 차이를 보여주었지만 통계학적으로 유의적인 감소를 보여주지 않았다
(도 4b). 그러나, 림프절 전이 용적에서의 감소뿐만 아니라 고도로 유의적인 siRNA
CD31
특이적 종양 성장 억제
는 지질복합된 siRNA
CD31
(도 3b)을 사용한 전신 처리시 관찰된다(도 4b). 전처리 대조군 그룹(35일째에 희생된
9마리의 무자위 마우스)과의 비교는 종양 및 전이 둘다의 추가의 성장이 siRNA
Luc
- 및 siRNA
Tie2
-지질복합체 처리
시 관찰되었지만 siRNA
CD31
로 처리된 마우스에서는 관찰되지 않았음을 지적한다. 본 발명자는 종양 조직의 내피
세포에서 정량 RT-PCR에 의해 표적 mRNA 발현 수준을 측정하고자 하였지만 아마도 당해 특정 종양 유형의 혈관
계로부터 유래된 mRNA의 양이 매우 낮아 mRNA 수준을 정확하게 정량할 수 없었다. 따라서, 본 발명자는 효능 실
험에서 사용되는 상이한 처리 그룹의 상응하는 마우스로부터 폐 조직중의 CD31, Tie2 및 CD34에서의 변화를 측
정하는데 주력하였다(도 4b). 본 발명자는 폐 내피가 당해 기술에 의해 효율적으로 표적화될 수 있고 CD31
mRNA 녹다운이 당해 조직에서 실험적으로 입증될 수 있음을 관찰하였다(문헌참조: (Santel et al., 2006)).
siRNA
Tie2
- 및 siRNAC31-지질복합체로 처리된 마우스는 서열 특이적 방식으로 상응하는 mRNA 수준의 상당한 감소
를 보여주었고 이것은 PC-3 오르토토픽 효능 연구에서 적용된 siRNA-지질복합체의 기능을 입증한다(도 4c). 대
조적으로, siRNA
Luc
-지질복합체로 처리된 대조군 마우스는 CD31 및 Tie2 수준에서 어떠한 억제를 나타내지 않았
다. 또한, 내피 특이적으로 발현된 유전자 CD34의 양은 임의의 치료 그룹에서 영향받지 않았다. 이를 종합하여
볼때, 2개의 생체내 이종이식 실험은 종양/전이 성장이 siRNA
CD31
-지질복합체의 반복적인 전신 투여에 의해 선택
적으로 억제됨을 입증한다. 당해 데이터는 CD31 (PECAM-1)인 비-전형적 약물 표적이 RNAi-기본 혈관형성 억제
치료 간섭을 위해 적합한 유전자 표적일 수 있음을 의미한다.
실시예 7: 23량체의 siRNA의 표적 특이성과 19량체 siRNA의 표적 특이성의 비교<256>
본 실험의 목적은 사람 23량체 siRNA
CD31-8
가 상응하는 19량체 siRNA
CD31-8
과 동일한 효능을 보여준다는 증거를 제<257>
시하기 위한 것이었다.
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실험 과정은 기본적으로 상기 실험에 명시된 것에 상응한다. 보다 구체적으로, HUVEC은 AtuFECTOl과 함께 2nM<258>
에서 각각의 siRNA로 형질감염시켰다. 단백질 녹다운은 형질감염 27시간후 웨스턴 블롯으로 평가하였다. 이의
결과는 도 6에 나타낸다.
웨스턴 블롯으로부터 취해질 수 있는 바와 같이, 사람 CD31에 대해 특이적으로 지시되고 23개 염기쌍 또는 19개<259>
염기쌍을 갖는 siRNA는 CD31을 녹다운시키는데 고도로 효과적이다. 사용되는 당해 분자 및 이의 일본쇄는 또한
도 6에 특정되어 있고 이때, 23개 염기쌍을 포함하는 CD31의 사람 서열에 대해 특이적으로 지시된 당해 siRNA
분자는 CD3 l_8_h_23량체로서 언급되고 19개 염기쌍을 포함하는 CD31의 사람 및 마우스 서열 둘다에 대해 지시
된 CD31_8_hm_19량체로서 언급된다.
임의의 경우, 문자 "h"는 서열이 표적 mRNA의 사람 서열에 대해 특이적임을 지적하는 것인 반면 문자 "hm"은 당<260>
해 서열이 표적 mRNA의 마우스 및 사람 서열 둘다에 대해 특이적임을 지적하는 것이다. 굵게 나타낸 뉴클레오
타이드는 2-O'-Me-변형된 것이다.
도 5에서 보여지는 웨스턴 블롯에서 siRNA
Luc
는 음성 대조군(ut: 비처리된)으로서 사용하였다. 당해 루시퍼라제<261>
특이적 siRNA 분자의 특정 서열은 다음과 같다:
Luc-siRNA-lB<262>
Cguacgcggaauacuucga<263>
Luc-siRNA-lA<264>
ucgaaguauuccgcguacg<265>
본원에 특정된 바와 같은 19량체 및 23량체 이본쇄 핵산이 CD31 mRNA를 녹다운시키는데 효과적이라는 실험적 증<266>
거를 제공하는 것외에, 종 특이성이 또한 나타난다. 당해 목적을 위해, 사람 23량체는 각각 마우스 및 랫트 동
족체에 대한 상응하는 23량체와 비교한다. 각각의 쇄는 또한 도 5에 나타내고 여기서 CD31-8-m-23-A는 안티센
스 쇄( 5' -> 3'- 방향)를 나타내고, CD31-8-m-23-B는 마우스 센스 쇄(5' -> 3'-방향으로 지적된)를 지적하며,
CD31-8-r-23-A는 래트 안티센스 쇄(5'-> 3 '-방향으로 지적됨)를 지적하고 CD31-8-r-23-B는 래트 센스 쇄(5'
-> 3'-방향으로 지적됨)을 지적한다.
참조문헌<267>
본원에서 당업계의 다양한 문헌이 언급되는 정도로, 다음과 같은 완전한 목록의 당해 문헌이 전반적으로 본원에<268>
참조로서 인용된다.
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공개특허 10-2009-0004984
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본 명세서, 청구항, 서열목록 및/또는 도면에 기재된 본 발명의 특징은 별도로 및 임의의 조합적으로 다양한 형<282>
태로 본 발명을 실현하기 위한 소재일 수 있다.
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도면
도면1
도면2a
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도면2b
도면2c
도면2d
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도면3a
도면3b
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도면3c
도면4a
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도면4b
도면4c
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도면5
서 열 목 록
SEQUENCE LISTING
<110> atugen AG
<120> Means for inhibiting the expression of CD31
<130> A 19027 PCT
<160> 11
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 3223
<212> RNA
<213> Homo sapiens
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<220>
<221> mRNA
<222> (1)..(3223)
<223> mRNA of CD31
<400> 1
ccaggcccca uuguucccgg uuuccagcca uggcugccau uaccugacca gcgccacagc 60
cggucucucu gcaggcgccg ggagaaguga ccagagcaau uucugcuuuu cacagggcgg 120
guuucucaac ggugacuugu gggcagugcc uucugcugag cgagucaugg cccgaaggca 180
gaacuaacug ugccugcagu cuucacucuc aggaugcagc cgaggugggc ccaaggggcc 240
acgauguggc uuggaguccu gcugacccuu cugcucuguu caagccuuga gggucaagaa 300
aacucuuuca caaucaacag uguugacaug aagagccugc cggacuggac ggugcaaaau 360
gggaagaacc ugacccugca gugcuucgcg gaugucagca ccaccucuca cgucaagccu 420
cagcaccaga ugcuguucua uaaggaugac gugcuguuuu acaacaucuc cuccaugaag 480
agcacagaga guuauuuuau uccugaaguc cggaucuaug acucagggac auauaaaugu 540
acugugauug ugaacaacaa agagaaaacc acugcagagu accagguguu gguggaagga 600
gugcccaguc ccagggugac acuggacaag aaagaggcca uccaaggugg gaucgugagg 660
gucaacuguu cugucccaga ggaaaaggcc ccaauacacu ucacaauuga aaaacuugaa 720
cuaaaugaaa aaauggucaa gcugaaaaga gagaagaauu cucgagacca gaauuuugug 780
auacuggaau uccccguuga ggaacaggac cgcguuuuau ccuuccgaug ucaagcuagg 840
aucauuucug ggauccauau gcagaccuca gaaucuacca agagugaacu ggucaccgug 900
acggaauccu ucucuacacc caaguuccac aucagcccca ccggaaugau cauggaagga 960
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gcucagcucc acauuaagug caccauucaa gugacucacc uggcccagga guuuccagaa 1020
aucauaauuc agaaggacaa ggcgauugug gcccacaaca gacauggcaa caaggcugug 1080
uacucaguca uggccauggu ggagcacagu ggcaacuaca cgugcaaagu ggaguccagc 1140
cgcauaucca aggucagcag caucgugguc aacauaacag aacuauuuuc caagcccgaa 1200
cuggaaucuu ccuucacaca ucuggaccaa ggugaaagac ugaaccuguc cugcuccauc 1260
ccaggagcac cuccagccaa cuucaccauc cagaaggaag auacgauugu gucacagacu 1320
caagauuuca ccaagauagc cucaaagucg gacaguggga cguauaucug cacugcaggu 1380
auugacaaag uggucaagaa aagcaacaca guccagauag ucguauguga aaugcucucc 1440
cagcccagga uuucuuauga ugcccaguuu gaggucauaa aaggacagac caucgaaguc 1500
cguugcgaau cgaucagugg aacuuugccu auuucuuacc aacuuuuaaa aacaaguaaa 1560
guuuuggaga auaguaccaa gaacucaaau gauccugcgg uauucaaaga caaccccacu 1620
gaagacgucg aauaccagug uguugcagau aauugccauu cccacgccaa aauguuaagu 1680
gagguucuga gggugaaggu gauagccccg guggaugagg uccagauuuc uauccuguca 1740
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ggucccauca ccuauaaguu uuacagagaa aaagagggca aacccuucua ucaaaugacc 1860
ucaaaugcca cccaggcauu uuggaccaag cagaaggcua acaaggaaca ggagggagag 1920
uauuacugca cagccuucaa cagagccaac cacgccucca guguccccag aagcaaaaua 1980
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gagaaaaugu cagaucccaa uauggaagcu aacagucauu acggucacaa ugacgauguc 2220
ggaaaccaug caaugaaacc aauaaaugau aauaaagagc cucugaacuc agacgugcag 2280
uacacggaag uucaaguguc cucagcugag ucucacaaag aucuaggaaa gaaggacaca 2340
gagacagugu acagugaagu ccggaaagcu gucccugaug ccguggaaag cagauacucu 2400
agaacggaag gcucccuuga uggaacuuag acagcaaggc cagaugcaca ucccuggaag 2460
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uuaugaaccu gcccugcucc cacagaacac agcaauuccu caggcuaagc ugccgguucu 2580
uaaauccauc cugcuaaguu aauguugggu agaaagagau acagaggggc uguugaauuu 2640
cccacauacc cuccuuccac caaguuggaa cauccuugga aauuggaaga gcacaagagg 2700
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