파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포 형성억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법(AGENT CONTROLLING THE PRODUCTION OFOSTEOCLAST-FORMATION REGULATOR AND METHOD OF SCREENINGSUBSTANCE ..

공개특허 10-2004-0051574
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(19)대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(51) 。Int. Cl.7
A61K 31/7016
(11) 공개번호
(43) 공개일자
10-2004-0051574
2004년06월18일
(21) 출원번호 10-2003-7007394
(22) 출원일자 2003년06월03일
번역문 제출일자 2003년06월03일
(86) 국제출원번호 PCT/JP2002/010604 (87) 국제공개번호 WO 2003/033003
(86) 국제출원출원일자 2002년10월11일 (87) 국제공개일자 2003년04월24일
(30) 우선권주장 JP-P-2001-003173582001년10월15일 일본(JP)
(71) 출원인 가부시끼가이샤 하야시바라 세이부쓰 가가꾸 겐꾸조
일본국 오까야마껭 오까야마시 시모이시 1죠메 2-3
(72) 발명자 아리야스도시오
일본국오까야마껭오까야마시시모이시1죠메2-3,가부시끼가이샤하야시바라세이부쓰가가꾸겐꾸조내
하나야도시하루
일본국오까야마껭오까야마시시모이시1죠메2-3,가부시끼가이샤하야시바라세이부쓰가가꾸겐꾸조내
아라이시게유키
일본국오까야마껭오까야마시시모이시1죠메2-3,가부시끼가이샤하야시바라세이부쓰가가꾸겐꾸조내
이케다마사오
일본국오까야마껭오까야마시시모이시1죠메2-3,가부시끼가이샤하야시바라세이부쓰가가꾸겐꾸조내
구리모토마사시
일본국오까야마껭오까야마시시모이시1죠메2-3,가부시끼가이샤하야시바라세이부쓰가가꾸겐꾸조내
(74) 대리인 최재철
서장찬
김기종
권동용
심사청구 : 없음
(54) 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포 형성억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질의
스크리닝 방법
요약
파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는
방법을 제공하는 것을 과제로 하고, 당질을 유효성분으로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포
형성 억제인자 생산 능력을 가진 배양주화 세포를 영양배지에서 배양하고, 여기에 피검체를 첨가하여, 이 피검체 존
재하에서 이 배양주화 세포를 배양하고, 이어서, 배양 상청중으로 방출된 파골세포 형성 억제인자의 양을 측정하여,
대조의 측정값과 대비함으로써 피검체의 측정값이 대조의 측정값을 상회하거나 하회할 때, 이 피검체가 파골세포 형
성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질인 것으로 판정하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 형성 억제인자의 생산을
조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법에 의해 상기 과제를 해결한다.
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대표도
도 1
명세서
기술분야
본 발명은, 신규의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 보다 상세하게는 당질을 유효성분으로 하는 파골세포 형성
억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
배경기술
인간을 포함한 포유 동물에 있어서의 골아세포(骨芽細胞), 간장, 신장, 폐, 심장 등의 장기 유래의 세포로부터 생산되
는 것이 알려져 있는 파골세포 형성 억제인자 [오스테오프로테제린(OPG)]은 중요한 뼈흡수 억제인자로서 최근 주목
받고 있다. 그 유전자는, 시모네트·W·S 등에 의해, 『Cell』, 제89권, 309 내지 319 페이지 (1997년)에서 보고되
어, 그 연구는 급속히 진행되고 있다. 이 파골세포 형성 억제인자는 피 속에도 존재하고, 뼈 대사에 대하여 전신성으로
작용해서 파골세포형성을 억제한다고 하고 있다. 따라서, 파골세포의 형성이 이상한 상태에 있는 인간을 포함한 포유
동물을 정상화하는 수단으로서, 그러한 상태에 있는 포유동물의 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 조절할 수 있으
면, 파골세포의 형성을 정상적 인 상태로 유지하여 뼈를 건강한 상태로 유지할 수 있는 것이 된다.
그러나, 그러한 파골세포 형성 억제인자의 생산량의 조절에 관한 보고는 거의 없다. 이러한 상황하에서 파골세포 형성
억제인자의 생산량을 조절할 수 있음과 아울러 병원, 요양소 이외의 일반 가정에서 안전하고도 손쉽게 일상적으로 상
용(常用)할 수 있는 약제의 확립이 크게 기대되고 있다.
이와 같은 상황을 고려하여 발명의 제1의 과제는, 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 조절할 수 있음과 아울러, 병원
, 요양소 이외의 일반가정에 있어서 안전하고도 손쉽게 일상적으로 상용할 수 있는 파골세포 형성 억제인자의 생산
조절제를 확립하는 것에 있다. 또한, 본 발명의 제2의 과제는, 그러한 생산 조절제의 유효성분으로서 배합할 수 있는
물질을 신속, 간편하고도 정확하게 스크리닝하는 방법을 제공하는 것에 있다.
발명의 상세한 설명
본 발명자들은, 당질, 특히, 비환원성 2당류인 α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스 및 β,β-트레할로오스 (본
발명에 있어서는, 별달리 명시하지 않는 한, 이들 트레할로오스를 간단히 『트레할로오스』라 한다.)의 약리작용에
대해서 예의 연구하는 중, 인간 소장점막 상피세포를 트레할로오스 존재하에서 배양하면, 파골세포 형성 억제인자 [
오스테오프로테제린(OPG)]의 생산이 촉진되는 것과, 각종 당질 중에는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 억제하는
것이 있는 것을 신규로 발견하였다. 또한, 본 발명자들은, 파골세포 형성 억제인자 생산 능력을 가진 배양주화 세포를
트레할로오스 존재하에서 배양하면, 그 배양액중에의 파골세포 형성 억 제인자의 생산이 촉진되는 것을 신규로 발견
하였다. 이들 발견에 근거하여 본 발명이 완성된 것이다.
즉, 본 발명은, 상기 제1의 과제를, 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 유효성분으로 하는 파골
세포 형성 억제인자의 생산 조절제에 의해 해결하는 것이다.
또한, 본 발명은, 특정한 배양주화 세포를 이용하여 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 스크리
닝하는 방법을 제공함으로써 상기 제2의 과제를 해결하는 것이다.
도면의 간단한 설명
도 1은, 각종 당질존재하 혹은 비존재하에 있어서의 배양 2일째의 세포배양 상청중에 함유되는 파골세포 형성 억제인
자의 발현 강도(상대값)를 나타내는 도면이다.
[발명을 실시하기 위한 최선의 형태]
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본 발명은, 당질을 유효성분으로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제, 및 파골세포 형성 억제인자의 생산을
조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 사용하는 당질로서는, D-글루코오스, D-만노
스, D-갈락토오스, D-알로오스, D-알트로오스, D-이도오스, D-아라비노오스, D-리보오스, D-시키로오스, D-릭소
오스, D-푸코오스, D-프룩토오스, D-탈로오스, L-소르보오스, D-타가토오스 및 D-프시코오스 등의 단당류, 말토오
스, 트레할로오스, 수크로오스, 락토오스, 투라노오스 및 루티노오스 등의 이당류, 말토트리오스 및 락토수크로오 스
등의 3당류 이상의 올리고당, 전분 부분 분해물, 및 이들 당질의 당 알코올류, 더욱이, 사이클로{→6)-α-D-글루코피
라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→6)-α-D-글루코피라노실-(1→3)-α-D-글루코피라노실-(1→}의 구조
를 가진 4당류 및 사이클로덱스트린 등의 환상당질로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질을 단독 또는 적당히 조
합해서 사용할 수 있다.
본 발명에 있어서는 이들 당질 중에서, 특히, 트레할로오스는, 인간을 포함하는 포유류에 있어서 파골세포 형성 억제
인자의 생산을 조절할 수 있는 물질로서, 구체적으로는, 파골세포 형성 억제인자의 생산을 촉진하는 물질로서 적절하
게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제에 있어서 트레할로오스를 유효성분으로서
사용할 경우, 트레할로오스의 이성체인, α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스, 및 β,β-트레할로오스 중의 하나
또는 복수를, 합계로서 유효량 사용하면 좋고, 또한, 이들 트레할로오스는 순품이 아니어도 좋으며, 공존하는 것 기타
의 성분이 트레할로오스 본래의 작용을 손상하지 않는 한, 그 조제 방법, 순도, 성상, 유래는 특히 묻지 않는다.
본 발명에서 사용하는 트레할로오스의 제조 방법에 관하여, 본 발명은 트레할로오스의 제조 방법자체에 관한 발명이
아니므로 상세한 설명은 생략하지만, 제조의 용이성, 경제성, 얻게되는 트레할로오스의 품질을 중시할 경우에는 본 발
명과 동일한 출원인에 의한 일본국의 특개평7-143876호 공보, 특개평7-213283호 공보, 특개평7-322883호 공보,
특개평7-298880호 공보, 특개평8-66187호 공보, 특개평8-66188호 공보, 특개평8-336388호 공보 및 특개평8-8
4586호 공보의 어느 하나에 개 시된 비환원성 당질생성 효소 및 트레할로오스 유리 효소를 전분 부분 가수 분해물에
작용시키는 방법이 적합하다. 이들의 방법에 의할 때에는, 염가의 재료인 전분으로부터 고품질의 α,α-트레할로오스
를 높은 수득량으로 용이하게 얻을 수 있다. 즉, 이와 같은 방법에 의해 조제된 시판품으로서는 결정성 트레할로오스
분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 및 트
레할로오스 함유 시럽 (상품명 『트레하스타』, 고형분 중량당의 트레할로오스 함량 28％ 이상, 일본국의 주식회사
林原상사 판매)이 있다. 그리고 α,α-트레할로오스는, 말토오스에, 예를 들면, 본 발명과 동일한 출원인에 의한 일본
국의 특개평7-170977호 공보, 특개평8-263호 공보, 특개평8-149980호 공보 중의 어느 하나에 기재된 말토오스·
트레할로오스 변환효소를 작용시키거나, 혹은 공지의 말토오스·포스포릴라아제 및 트레할로오스·포스포릴라아제
를 조합하여 작용시킴에 의해서도 얻을 수 있다.
α,β-트레할로오스를 조제하기 위해서는, 예를 들면, 동일한 특허출원인에 의한 일본국 특개평4-144694호 공보 및
특개평4-179490호 공보에 기재된 방법에 따라서 전분 부분 가수 분해물과 락토오스의 혼합물에, 시클로말토덱스트
린·글루카노트란스페라아제 (CGTase)와 β-갈락토시다아제를 이 순서로 작용시키면 좋다. 또한, β,β-트레할로
오스는 공지의 화학합성에 의해 얻을 수 있다. 그리고 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제는 경구적 또
는 경관적으로 소화관내에 투여되는 것이므로, 최고 순도의 당질에 한정될 필요성은 없고, 비교적 저순도의 당질, 즉,
당질과 함께, 그 조제 방법에서 기인하는 기타의 성분과의 조성물의 형 태, 즉, 인간을 포함하는 포유류에 있어서, 당
질에 의한 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하는 작용을 실질적으로 방해하지 않는 기타의 적당한 성분과의 혼
합물의 형태이어도 좋다.
또한, 본 발명에서 사용하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절 능력을 가진 물질로서는, 다음에 설명하는 파골세포
형성 억제인자의 생산 조절 능력을 가진 물질을 스크리닝하는 방법에 의해 선택되는 파골세포 형성 억제인자의 생산
조절 능력을 가진 물질 전반을 포함한다. 본 발명에 있어서는, 이 스크리닝 방법에 의해 선택된 물질로서 당질을 예시
하고 있지만, 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절 능력을 가진 물질로서 인간을 포함하는 포유 동물에게 경구적 또는
경관적으로 투여가능한 물질이면, 당질과 마찬가지로 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절 능력을 가진 물질로서 이
용할 수 있다. 따라서, 본 발명에 있어서는, 본 발명의 스크리닝 방법에 의해 선택된 1종 또는 2종 이상의 물질을 본
발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제의 유효성분으로서 이용할 수 있다.
본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질 단독의
형태이어도 좋고, 기타의 성분을 적당히 배합해서 된 조성물의 형태이어도 좋다. 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의
생산 조절제는, 통상, 경구섭취, 경관 유동식이나 경관 수액 등의 경관적으로 투여되는 형태의 식품, 건강식품, 건강보
조 식품 및 의약품 등의 조성물, 보다 구체적으로는 용액상, 현탁액상, 유액상, 크림상, 페이스트상, 분말상, 과립상,
혹은 그 이외의 소망의 형상으로 성성된 조성물의 형태로 제공된다. 즉, 조성물이 식품으로서의 형 태인 경우에는, 예
를 들면, 물, 알코올, 전분질, 단백질, 섬유, 당질, 지방질, 각종 비타민류, 미네랄, 착향료, 착색료, 감미료, 조미료, 향
신료, 안정제, 산화 방지제, 방부제, 증점제, 부형제 등, 식품에 보통 이용되는 원료 및/또는 소재를 파골세포 형성 억
제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질의 섭취를 용이하게 하는 성분으로서 배합할 수 있다. 이와 같은 조성물에, 또한,
비피더스균, 비피더스균 증식 당질, 분말 밀크, 유(乳)단백 분해물(카제인 칼시움 펩티드, 카제인포스포펩티드), 락토
페린, 대두 이소플라본, 혈분, 뼛가루, 조개껍질 가루, 산호 분말 등의 건강보조 식품 소재의 1종 또는 2종 이상을 적
당히 배합할 수도 있다. 이와 같은 식품은 경구섭취되는 형태뿐만 아니라 경관 유동식이나 경관 수액 등의 경관적으로
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투여되는 형태이어도 좋다.
또한, 의약품으로서의 형태인 경우에는, 예를 들면, 담체, 부형제, 희석제 및 안정제의 1종 또는 2종 이상을 기타의 성
분으로서 배합하고, 또한 필요에 따라서, 예를 들면, 락트산 칼슘, 글리세로인산 칼슘, 인산수소 칼슘 및 L-아스파라
긴산 칼슘 등의 칼슘제, 더욱이, 진통제, 소염제, 활성형 비타민 D제, 비타민 K제, 칼시토닌 제제, 에스트로겐 제제, 단
백질 동화 호르몬 제제 등의 기타의 약제의 1종 또는 2종 이상을 배합해서 조성물로 하는 것도 마음대로이다. 사용 형
태에도 따르지만, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제는, 통상, 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절
할 수 있는 물질을 0.1％（w/w) 이상, 바람직하게는, 1％（w/w) 이상 함유한다.
본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제의 용법에 대해서 인간의 경우를 예로 들어서 설명하면, 이 파골세
포 형성 억제인자의 생산 조절제는 경구적으로 사용해도, 그리고 경관적으로 사용해도 인간의 소장점막 상피세포에
작용하여 이 세포에 있어서의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 효과적으로 조절한다. 또한, 이 파골세포 형성 억제
인자의 생산 조절제는 경구적 또는 경관적으로 투여한 어느 경우에도 포유 동물의 소장점막 상피세포에 작용하여 파
골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하고, 파골세포의 형성을 효과적으로 억제한다. 따라서, 본 발명의 파골세포 형성
억제인자의 생산 조절제는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제뿐만 아니라, 골절이나 뼈의 금 등의 뼈관련 질환을
예방, 치료, 개선하기 위해 사용할 수 있다. 또한, 사용 목적에도 따르지만, 예를 들면, 뼈의 건강을 유지·증진하거나
할 경우에는, 통상, 식품의 형태로 경구적으로 섭취한다. 그리고 요통·관절통의 완화, 뼈의 손상·질환의 치료 효과
의 개선을 목적으로 할 경우에는, 통상, 식품 또는 액제, 시럽제, 가루약, 과립제, 정제, 캡슐제 등의 의약품의 형태로
경구적으로 투여하거나, 액상의 형태로 경관적으로 투여한다. 용량은, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절
제중에 함유되는 유효성분의 양으로서, 통상, 약 1g 내지 100g/성인/일, 바람직하게는, 약 2g 내지 50g/성인/일이 되
도록 해서 매일 투여하거나, 혹은 1회 내지 5회/주의 빈도로 투여한다. 투여 기간은, 사용 목적, 투여하는 인간 또는
포유동물의 증상에 따라서 적당히 달라지지만, 통상, 1개월 이상, 바람직하게는 3개월 이상, 보다 바람직하게는 6개월
이상 투여하는 것이 바람직하다. 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제의 유효성분으로서 당질을 사용할 경우에는,
당질이 생체의 에너지원으로서도 유용하고, 또한 당질은 장기간 투여해 도 안전한 물질이므로, 본 발명에 있어서는
가장 적절하게 이용할 수 있다.
이어서, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법에 대해서 설명한다.
이 방법은, 파골세포 형성 억제인자 생산 조절 능력을 가진 배양주화 세포를 영양배지 중에서 배양하고, 여기에 피검
체를 첨가하고, 이 피검체 존재하에서 이 배양주화 세포를 배양한 다음에, 배양 상청 중으로 방출된 파골세포 형성 억
제인자의 생산량을 측정하고, 대조의 측정값과 대비함으로써, 피검체의 측정값이 대조의 측정값을 상회하거나 하회할
때, 이 피검체가 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질로서 판정함으로써, 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법이다. 이와 같은 스크리닝 방법은 특수한 기구, 설비를 필요로 하지
않지만, 소망의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 신속, 간편하고도 정확하게 스크리닝할 수
있는 이점을 가지고 있다.
상기 배양주화 세포로서는, 예를 들면, 골수종(骨髓腫) 유래의 주화(株化) 세포인 MG-63 세포(ATCC CRL 1427) 및
인간태아 소장 상피세포 유래의 주화 세포인 FHs74lnt 세포(ATCC CCL 241)를 적절하게 이용할 수 있다. 본 발명에
있어서는, 이들 배양주화 세포에만 한정되지 않고, 파골세포 형성 억제인자 생산 능력을 가진 배양주화 세포이면 모두
이용할 수 있다. 또한, 상기 배양주화 세포를 배양할 때에 이용하는 영양배지로서는 당질 불함유의 무혈청 배지가 적
절하게 이용된다. 구체적으로는, 당질 및 혈청 불함유의 MEM 배지, RPMI1640 배지 등의 배지이며, 이 배양주화 세
포가 증식가능한 배지이면 모두 이용할 수 있다. 배양주화 세포의 배양은, 통상, 배양 시간은 24 내지 72시간이고, 세
포 최종농도가 1 ×lO 3 내지 1 ×lO 7개/ml, 적절하게는, 5 ×lO 3 내지 1 ×lO 6개/ml가 되도록, 이 배양주화 세포
를 1개 내지 2개 이상의 복수의 구멍을 가진 배양기, 예를 들면, 1개 내지 2개 이상의 복수의 구멍을 가진 플레이트상
배양기를 사용하고, 30 내지 40℃, 적절하게는 35 내지 38℃에서, 5％（v/v) CO 2 인큐베이터 중에서 배양하고, 이
어서, 배양에 사용한 것과 마찬가지의 배지를 사용해서 수회 세포를 세정한 다음에 배지를 제거한다. 배양액을 제거한
후의 세포에, 상기 배지를 사용해서 미리 단계 희석해 둔 스크리닝 해야 할 피검체를 함유하는 배지를 소정량 첨가하
고, 상기 배양 조건에서 1 내지 5일간 배양한다. 대조로서는 피검체를 함유하지 않은 계를 사용하였다. 이 배양기간
동안의 소정시간에 배양액의 일부와 대조의 배양액의 일부를 샘플링하여 각 샘플링액 중의 파골세포 형성 억제인자
의 생산량을 측정하고, 피검체의 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 대조의 그것과 비교하여 피검체의 측정값이 대
조의 측정값을 상회하거나 하회할 때, 피검체가 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질이라고 판정한
다.
이와 같이, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 스크리닝하는 방법에 의하면, 목적으
로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 단시간에 용이하고도 효율적으로 스크리닝할 수 있
다는 실익을 가진다. 또한, 본 발명의 스크리닝 방법은 실험 동물을 필요로 하지 않고, 소규모의 실험실·임상 검사실
등에서 용이하게 실시할 수 있다는 편리성과 경제성 을 겸비하고 있다.
이어서, 실험예에 근거하여 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제의 유효성과 안전성에 대해서 설명한다.
공개특허 10-2004-0051574
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실험 1:파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질에 의한 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절
실험 1-1: 세포 배양액의 조제
FHs74lnt 세포(ATCC CCL 241)를 96 구멍 플레이트에 최종 세포농도 1.2 ×lO 4 개/구멍, 최종 액량 200㎕가 되도
록, 아래의 표 1에 나온 무혈청 배지에 최종 농도로 10％（v／v)의 소 태아 혈청 (기부코사제)을 첨가한 D-MEM 배
지중에서 37℃ 및 5％（v／v) CO 2 인큐베이터내에서 48시간 배양하였다. 배양 종료후, 표 1에 나온 무혈청 D-ME
M 배지를 사용하여 세포를 3회 (200㎕/회) 세정하였다. 이어서, 시험군으로서 상기한 바와 같은 D-MEM 배지를 사
용하고 표 2에 나온 조성으로 된 당질 용액 No. 1 내지 No. 7, 즉, D-글루코오스 (순도 99％ 이상, 일본국의 片山화학
공업 주식회사제) 1mg/ml 용액 (당질용액 No. 1), 수크로오스 (순도 99％ 이상, 일본국의 和光純藥공업 주식회사제)
1mg/m1 용액 (당질용액 No. 2), 말토오스 (상품명 「말토오스 HHH」, 순도 99％ 이상, 일본국의 주식회사 林原생물
화학 연구소제) 1mg/ml 용액 (당질 용액 No. 3), α,α-트레할로오스 (순도 99％ 이상, 일본국의 和光純藥공업 주식
회사제) 1,0.2 및 0.04mg/ml 용액 (당질용액 No. 4 내지 N o.6), 또는 D-글루코오스 (순도 99％ 이상, 일본국의 和光
純藥공업 주식회사제) 1mg/ml와 α,α-트레할로오스 (순도 99％ 이상, 일본국의 和光純藥공업 주식회사제) 1mg/ml
을 함유하는 용액 (당질용액 No. 7)을 조제하고, 이들 각 용액의 200㎕을 96 구멍 플레이트의 각 구멍에 첨가한 후,
세포를 37℃ 및 5％（v／v) CO 2 인큐베이터내에서 2일간 배양하고, 세포 배양액 상청의 일부를 각각 샘플링하여
각 배양 상청중의 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 재조합형 인간 파골세포 형성 억제인자 (Ramp;D 시스템 주식
회사제)를 표준품으로 하여, 아래에 나온 웨스턴 블로팅법에 의해 측정하였다. 시험군과 병행하여, 대조로서 당질 무
첨가의 계를 구성하고, 시험군과 마찬가지로 배양 2일째에 세포 배양액의 상청의 일부를 샘플링하고, 그 배양 상청 중
의 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 시험군과 마찬가지로 해서 측정하였다.
[표 1]
<무혈청 배지조성>
D-글루코오스 불함유 D-MEM 배지 (기부코사제)
MEM 비필수 아미노산용액 (기부코사제)
MEM 비르빈산 나트륨 용액 (기부코사제)
아(亞)세렌산 나트륨 (최종 농도 20nM, 시그마사제)
트란스페린 (최종 농도: 5㎍/ml, 시그마사제)
인슐린 (최종농도: 5㎍/ml, 시그마사제)
[표 2]
<각 당질용액>
당질 용액
No. 당 질 당질 농도
1 D-글루코오스 1mg/ml
2 수크로오스 1mg/ml
3 말토오스 1mg/ml
4 α,α-트레할로오스 1mg/ml
5 α,α-트레할로오스 0.2mg/ml
6 α,α-트레할로오스 0.04mg/ml
7
D-글루코오스

α,α-트레할로오스
1mg/ml
1mg/ml
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실험 1-2: 웨스턴 블로팅법
각 시험군 및 대조의 세포배양 상청 15㎕와 티티오드레이톨(DTT) 처리용액 5㎕를 혼합하고, 이 혼합액을 99℃에서
5분간 가열처리하였다. 각 가열 처리액을 멀티 겔 4/20 (일본국의 제일화학약품 주식회사제)에 의한 SDS-폴리아크
릴아미드 겔 전기영동(SDS-PAGE)으로 전개하고, PVDF 막(膜) (일본 밀리포아 주식회사제)에 전사(轉寫)하였다. 이
PVDF 막을 『블록 에이스』 (일본국의 大日本제약 주식회사제) 용액에 의해 블록킹한 후, 1차 항체로서 항 인간 파
골세포 형성 억제인자 항체(Ramp;D 시스템 주식회사제)와, 2차 항체로서 HRP 항 염소 IgG 항체 (시그마사제)를 사
용하고, 『實驗醫學 別冊 新遺傳子工學 핸드북』, 222 내지 226 페이지 (1999년) (松村正實 등 편집, 羊土社 출판)의
기재 내용에 기재된 웨스턴 블로팅법에 준하여 항체와 반응한 단백질을 검출하였다. 한편, 발색은 ECL 시약 (Amers
ham Pharmacia Biotechnology사제)을 사용하여, 『하이퍼 필름 ECL』 (Amersham Pharmacia Biotechnology사
제)을 노광시켜 『이미지 마스터』 (Amersham Pharmacia Biotechnology사제)에 의해 발현 강도를 측정하였다. 그
결과를 도 1에 나타낸다. 도 1에 있어서, 각종 당질에 의한 파골세포 형성 억제인자 생산량은, 대조의 배양계에서의
파골세포 형성 억제인자의 발현 강도를 100으로 하여 상대값（％)로 나타내었다. 그 결과, α,α-트레할로오스 및 α
,α-트레할로오스와 D-글루코오스를 병용했을 경우, 파골세포 형성 억제인자의 발현 강도는 대조를 상회했음에 대해
, D-글루코오스, 말토오스 및 수크로오스의 경우는 대조를 하회하였다.
이들의 결과로부터, α,α-트레할로오스는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 촉진하는 작용을 가지는 것에 대해, D-
글루코오스, 수크로오스 및 말토오스는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 억제하는 작용을 가진 것이 밝혀졌다. 또한,
트레할로오스와 D-글루코오스를 병용했을 경우, D-글루코오스는 α,α-트레할로오스의 파골세포 형성 억제인자의
생산을 촉진하는 작용을 증강하였다.
실험 2: 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하는 물질의 스크리닝 방법
실험 1에서 사용한 FHs74lnt 세포(ATCC CCL 241) 대신에, MG-63 세포(ATCC CRL 1427)을 사용한 이외는 실험
1과 마찬가지로 하고, 상기 표 2에 나온 조성으로 된 각종 당질용액 (당질용액 No. 1 내지 No. 7)을 사용하고, 이들
각 당질이 MG-63 세포로부터의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하는 것인가 아닌가에 대해서 조사하였다.
그 결과, α,α-트레할로오스는 당질 무첨가의 대조와 비교하여 파골세포 형성 억제인자의 생산을 현저하게 촉진하
였으므로, α,α-트레할로오스는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 현저하게 촉진하는 작용을 가진 물질인 것이 밝혀
졌다. 한편, D-글루코오스, 말토오스, 및 수크로오스는 당질 무첨가의 대조와 비교하여 파 골세포 형성 억제인자의 생
산을 현저하게 억제하였으므로, 이들 당질은 파골세포 형성 억제인자의 생산을 현저하게 억제하는 작용을 가진 물질
인 것이 밝혀졌다.
이 예에 있어서는, 각종 당질에 대해서 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하는가 아닌가를 스크리닝하는 방법을
예시한 것이지만, 당질 이외의 다른 천연 또는 합성의 각종 단백질, 유기·무기 화합물, 동식물로부터의 추출물, 다당
류, 호르몬 또는 각종 생리활성 물질에 대해서 이들의 물질이 소장점막 상피세포 유래의 세포로부터의 파골세포 형성
억제인자의 생산을 조절하는 것인가 아닌가에 대해서 마찬가지로 조사할 수 있다.
실험 3: 급성독성 시험
5 ％（w/w) 아라비아 검을 함유하는 생리식염수에 결정성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분
중량당의 α,α-트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본국의 주식회사 林原상사 판매), 순도 99％ 이상의 시약특급 D-글
루코오스, 말토오스 또는 수크로오스의 적당량을 용해한 후, 통상적인 방법에 따라서 멸균하였다. 각 당질 수용액을
체중 20 내지 25g의 ddY 마우스 (5군: 10마리/군)의 복강내에 각각 주사 투여 또는 위 존데에 의해 경관 투여한 후,
7일간에 걸쳐서 경과를 관찰하였다. 그 결과, 어떠한 투여 경로에 의해서도 α,α-트레할로오스, D-글루코오스, 말토
오스 또는 수크로오스를 15g/kg 체중의 비율로 투여한 모든 마우스에 있어서도 사망예는 나타나지 않았다. 이 결과
는, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제가 인간을 포함하는 포유류에 투여해도 안전한 것을 나타내고
있다.
실험 4: 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제의 투여 시험
35 내지 50세 되는 건강한 남녀 각 18명으로 된 지원자를 3군 (남녀 각 3명으로 된 A군, B군, C군)으로 나누고, 결정
성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본국의
주식회사 林原상사 판매)을 농도 10％（w/v)가 되도록 탈이온수 1,000ml에 용해하고, 막(膜)여과해서 제균하여 시험
액 1로 하였다. 또한, D-글루코오스 (순도 99% 이상, 일본국의 和光純藥공업 주식회사제)를 농도 10％（w/v)가 되
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도록 탈이온수 1,000ml에 용해하고, 막 여과해서 제균하여 시험액 2로 하였다. 그리고 대조로서, 탈이온수 1,000ml
을 막 여과해서 제균하여 대조액으로 하였다.
이들 시험액과 대조액은, 시험 개시까지 냉장고내 (약10℃)에 보관하였다. A ∼ C군의 피험자에 대하여, 시험 전야의
오후 10시 이후, 물 이외는 절식시키고, 다음날의 오전 6시에 A군의 피험자에는 각각 시험액을 100ml, B군의 피험자
에는 시험액 2를 각각 100ml, 그리고 C군의 피험자에는 대조액을 각각 100ml 경구섭취시켰다. 그 후, 각 군의 피험
자를 안정하게 실내에서 있게 하고, 6 시간후인 정오에 각피험자로부터 채혈하고, 채혈한 혈액을 초원심분리(35,000
r.m.p.에서 10분간)하고, 시판 후나코시 주식회사제의 파골세포 형성 억제인자 측정용 EL1SA 시스템 (상품번호 「R
SOOO805」)를 이용하여 파골세포 형성 억제인자의 생산량을 측정하였다.
그 결과, α,α-트레할로오스(시험액 1)를 경구섭취시킨 A군의 피험자의 혈액중의 파골세포 형성 억제인자의 생산량
은 D-글루코오스(시험액 2)를 경구섭취시킨 B군, 대조액을 경구섭취시킨 C군의 피험자와 비교하여 우세하게 높은
값을 나타내었다. 또한, D-글루코오스를 경구섭취시킨 B군은 물만 경구섭취시킨 C군과 비교 하여 파골세포 형성 억
제인자의 생산량이 유의하게 낮았다.
그리고 투여 시험 종료후, α,α-트레할로오스를 투여한 A군, D-글루코오스를 투여한 B군의 피험자 중에서 이상을
호소한 것은 없었다. 이 실험 결과로부터, α,α-트레할로오스는 생체에 경구적으로 투여했을 때, 파골세포 형성 억제
인자의 생산을 촉진하는 것이, 또한 D-글루코오스는 파골세포 형성 억제인자의 생산을 억제하는 것이 밝혀졌다.
이하, 실시예에 따라 본 발명의 실시의 형태에 대해서 구체적으로 설명한다.
실시예 1: 건강식품
통상적인 방법에 따라, 온도 20℃, 습도 85％에서 2주간 저장함으로써 환원당을 자기 소화시킨 감자를 수세하여 껍
질을 벗기고, 선별한 후, 원심식 슬라이서를 사용해서 두께 1.5mm의 슬라이스로 하였다. 수세에 의해 슬라이스 표면
의 전분을 제거한 후, 물기를 빼고, 온도 170℃에서 약 5분간 기름에 튀긴 후 기름을 제거하였다. 이어서, 솔터를 사용
하여 식염 7 중량부, 결정성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스
함량 98％ 이상, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 3 중량부 및 적당량의 향신료를 함유해서 된 분말 조미료를 균일
하게 뿌린 후, 칭량(稱量) 제대(製袋) 충전기에 옮기고, 거기에서 칭량하여 충전하고, 포장해서 스낵 과자상 식품을 얻
었다.
이 제품은, 정미(呈味), 풍미 모두 양호하고, 경구섭취했을 때 소장점막 상피에 작용하여 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절하며, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하므로 뼈의 건강을 유지·증진하는 건강식
품으로 서 유용하다.
실시예 2: 건강식품
잘 혼련한 버터 25 중량부에 결정성 α,α-트레할로오스 분말 (상품명 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로
오스 함량 98％ 이상, 일본국의 주식회사 林原상사 판매) 18 중량부와 계란 10 중량부를 이 순서로 각각 가해, 교반하
여 크림 상으로 하였다. 여기에 박력분 47 중량부를 첨가하여 혼련하고, 천에 싸서 20분간 방치해서 얻어진 생지를
지름 3cm의 봉상(棒狀)으로 한 후, 파라핀 페이퍼에 싸고 4℃에서 2시간 방치하였다. 그 후, 생지를 5mm의 두께로
둥글게 잘라 기름을 입힌 평판에 늘어 깔고, 170℃의 오븐에서 10분간 구운 후, 표면에 α,α-트레할로오스 함유 시
럽 (상품명 『Treha 스타』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 28％ 이상, 일본국의 주식회사 林原상사 판
매)을 도포하고, 같은 온도에서 다시 10분간 구워서 아이스 박스 쿠키를 얻었다.
이 제품은, 정미(呈味), 풍미 모두 양호하고, 경구섭취했을 때 소장점막 상피에 작용하여 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절하며, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하므로 뼈의 건강을 유지·증진하는 건강식
품으로서 유용하다.
실시예 3: 건강식품
동결 건조 홍차 엑기스 분말 7 중량부, α,β-트레할로오스 3 중량부, 및 D-글루코오스 3중량부를을 적당량의 물에
용해하고, 얻어진 용액을, 통상적인 방법에 따라 발효시키고 건조시킨 홍차잎 90 중량부에 뿌렸다. 통상적인 방법에
따라서 홍 차잎을 체질(sievinge)하고, 재단하여 마무리 건조하고, 선별기에 의해 이물을 제거한 후, 일본 종이를 사
용해서 2g 씩 티 백(tea bag) 포장해서 홍차 티 백을 얻었다.
이 제품은 냉수 180ml에 약 10분간 침출시키거나, 혹은 90 내지 100℃의 열탕 180ml에 약 2분간 침출시켜서 음용
한다.
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이 제품은, 정미(呈味), 풍미 모두 양호하고, 경구섭취했을 때 소장점막 상피에 작용하여 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절하며, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하므로 뼈의 건강을 유지·증진하는 건강식
품으로서 유용하다.
실시예 4: 건강식품
말토테트라오스 함유 시럽 [상품명 『테토랍푸』, 고형분 중량당 글루코오스 약 2％, 말토오스 약 7％, 말토트리오스
약 11％, 말토테트라오스 약 50％, 덱스트린 약 28％ 함유 (일본국의 주식회사 林原상사 판매)] 2.7 중량부, α,α-트
레할로오스 함유 시럽 (상품명 『Treha 스타』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 28％ 이상, 일본국의 주
식회사 林原상사 판매) 7 중량부, 커피 엑기스 5 중량부, 전지(全脂) 분유 2.2 중량부, 탈지 분유 1 중량부, 수크로오스
지방산 에스테르 0.04 중량부, 중조 0.06 중량부 및 물 82 중량부를 통상적인 방법에 따라서 배합해서 커피 음료를
얻었다.
이 제품은, 정미(呈味), 풍미 모두 양호하고, 경구섭취했을 때 소장점막 상피에 작용하여 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절하며, 뼈질환과 관련되는 파 골세포의 형성을 효과적으로 억제하므로 뼈의 건강을 유지·증진하는 건강
식품으로서 유용하다.
실시예 5: 건강보조 식품
결정성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본
국의 주식회사 林原상사 판매) 55 중량부, 콘 스타치 40.5 중량부 및 결정 셀룰로오스 2.5 중량부를 혼합하고, 통상적
인 방법에 따라 적당량의 물을 분무 적하하면서 혼련하여 유동층 조립(造粒)한 후, 분쇄하고, 정립(整粒)해서 타정용(
打錠用) 분체를 얻었다. 여기에 윤택제로서 수크로오스 지방산 에스테르 2 중량부를 균일하게 혼합한 후, 지름 11mm
의 펀리를 장착한 타정기(打錠機)에 의해 타정해서 α,α-트레할로오스를 함유하는 정제 (약 300mg/정)을 얻었다.
이 제품은 경구섭취하기 쉽고, 소장에서의 붕괴성이 우수하며, 소장점막 상피에 작용하여 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절하고, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하므로 뼈의 건강을 유지·증진하는 건강식
품으로서 유용하다.
실시예 6: 건강보조 식품
결정성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본
국의 주식회사 林原상사 판매) 39 중량부, 천연산호 분말 25 중량부, 분말 요구르트 12 중량부, 구아 검 10 중량부, 2
-0-α-D-글루코피라노실—L-아스코르브산 1.9 중량부 및 α-글리코실헤스페리딘 0.1 중량 부를 통상적인 방법에
따라서 적당량의 물을 분무 적하하면서 혼련하고, 유동층 조립한 후, 분쇄하여 정립해서 타정용 분체를 얻었다. 여기
에 윤택제로서 수크로오스 지방산 에스테르 3 중량부를 균일하게 혼합한 후, 지름 6mm의 펀치를 장착한 타정기에 의
해 타정하여 정제 (약 200mg/정)을 얻었다.
이 제품은 칼슘이 보강되어 있는 외에 경구섭취하기 쉬우므로, 소장에서의 붕괴성이 우수하고, 소장점막 상피에 작용
하여 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하므로, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하여 뼈의
건강을 유지·증진하는 건강보조 식품이다.
실시예 7: 건강보조 식품
결정성 α,α-트레할로오스 분말 (등록상표 『Treha』, 고형분 중량당의 α,α-트레할로오스 함량 98％ 이상, 일본
국의 주식회사 林原상사 판매) 3 중량부, α,β-트레할로오스 (순도 95％ 이상) 1 중량부, β,β-트레할로오스 1 중량
부 및 풀룰란 3 중량부를 혼합하고, 지름 6mm의 펀치를 장착한 타정기에 의해 타정하여 정제 (약 300mg/정)를 얻었
다.
이 제품은 풀룰란을 배합하고 있으므로 적당한 강도를 가지고, 소장에서의 붕괴성이 우수하고, 소장점막 상피에 작용
하여 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하므로, 뼈질환과 관련되는 파골세포의 형성을 효과적으로 억제하여 뼈의
건강을 유지·증진하는 건강보조 식품이다.
산업상 이용 가능성
이상 설명한 바와 같이, 본 발명의 당질을 유효성분으로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제에 의하면, 파골
세포 형성을 효과적으로 조절할 수 있다는 우수한 실익을 가진다. 또한, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조
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절제는, 당질을 유효성분으로 하므로 안전하고, 정미, 풍미 함께 양호하며, 경구섭취 또는 경관 투여했을 때 아무런 불
편없이 용이하게 섭취 또는 생체에 투여할 수 있고, 온화하게 소장점막 상피세포에 작용하여 이세포로부터의 파골세
포 형성 억제인자의 생산을 효과적으로 조절한다. 그 결과, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제는 뼈질
환과 밀접한 관련성을 가지는 파골세포의 형성을 효과적으로 조절하여 뼈의 건강을 유지·증진하기 위해서 유용하다.
또한, 본 발명의 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절 능력을 가진 물질의 스크리닝 방법에 따르면, 상기 파골세포 형
성 억제인자의 생산 조절제의 유효성분이 될 수 있는 물질을 폭넓게 신속하고도 용이하게 검색할 수 있으므로, 당질
이외의 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질을 용이하고도 효율적으로 스크리닝하는 것을 가능하
게 하는 것이다.
이렇게도 우수한 작용 효과를 나타내는 본 발명이 이 분야에 기여하는 영향은 크다.
(57) 청구의 범위
청구항 1.
당질을 유효성분으로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제.
청구항 2.
제1항에 있어서, 당질이, D-글루코오스, 말토오스, 수크로오스, α,α-트레할로오스, α,β-트레할로오스 및 β,β-
트레할로오스로부터 선택되는 1종 또는 2종 이상의 당질인 것을 특징으로 하는, 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절
제.
청구항 3.
제1항 또는 제2항에 있어서, 칼슘제를 더욱 함유해서 된 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제.
청구항 4.
제1항, 제2항 또는 제3항에 있어서, 포유동물의 소장점막 상피세포에 작용하여 이 세포에 있어서의 파골세포 형성 억
제인자의 생산을 조절하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제.
청구항 5.
제1항 내지 제4항 중의 어느 한 항에 있어서, 경구투여 또는 경관 투여되는 형태에 있는, 파골세포 형성 억제인자의
생산 조절제.
청구항 6.
파골세포 형성 억제인자 생산 능력을 가진 배양주화 세포를 영양배지 중에서 배양하고, 여기에 피검체를 첨가하여, 이
피검체 존재하에서 이 배양주화 세포를 배양하고, 이어서, 배양 상청중으로 방출된 파골세포 형성 억제인자의 양을
측정하고, 대조의 측정값과 대비함으로써, 피검체의 측정값이 대조의 측정값을 상회하거나 하회할 때, 이 피검체가 파
골세포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질이라고 판정하는 것을 특징으로 하는, 파골세포 형성 억제인자의
생산을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법.
청구항 7.
제6항에 있어서, 배양주화 세포가, MG-63 세포(ATCC CRL 1427) 또는 FHs74lnt 세포(ATCC CCL 241)인, 파골세
포 형성 억제인자의 생산을 조절할 수 있는 물질의 스크리닝 방법.
청구항 8.
제6항 또는 제7항 기재의 스크리닝 방법에 의해 선택된, 파골세포 형성 억제인자의 생산을 조절하는 물질을 유효성분
으로 하는 파골세포 형성 억제인자의 생산 조절제.
도면
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