(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(11) 공개번호 10-2012-0112452
(43) 공개일자 2012년10월11일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
A23L 1/30 (2006.01) A61K 35/74 (2006.01)
A61K 8/99 (2006.01) A61P 1/02 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2012-7014804
(22) 출원일자(국제) 2010년10월11일
심사청구일자 없음
(85) 번역문제출일자 2012년06월08일
(86) 국제출원번호 PCT/EP2010/065180
(87) 국제공개번호 WO 2011/057872
국제공개일자 2011년05월19일
(30) 우선권주장
09014070.8 2009년11월10일
유럽특허청(EPO)(EP)
(71) 출원인
바스프 에스이
독일 데-67056 루드빅샤펜
(72) 발명자
쿠페르, 브라이언
독일 68199 만하임 한스-사치스-링 14
(74) 대리인
위혜숙, 양영준
전체 청구항 수 : 총 14 항
(54) 발명의 명칭 건강 증진용 제제 및 제조 방법
(57) 요 약
본 발명은 건강 증진용 제제 및 그의 제조 방법 분야, 특히, 충치 예방을 위한, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해
특이적인 결합능을 가진, 열적으로 전처리된 락토바실러스 제제의 용도에 관한 것이다. 본 발명에 따른 독립항
은 락토바실러스 제제 및 열적 저온살균에 관한 것이다.
공개특허 10-2012-0112452
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특허청구의 범위
청구항 1
i) 스트렙토코쿠스 뮤탄스(streptococcus mutans)에 대해 특이적인 결합능을 갖는 락토바실러스
(Lactobacillus) 또는 락토바실리(Lactobacilli) 혼합물의 세포 현탁액을 0.5 내지 2℃/min의 온도 변화로 40
℃ 미만의 출발 온도로부터 75 내지 85℃의 저온살균 온도로 가온시키고, 여기서, 특이적인 결합은
a) 열 처리에 내성을 띠고/거나,
b) 프로테아제 처리에 내성을 띠고/거나,
c) 칼슘에 의존성이고/거나,
d) pH 4.5 내지 8.5 범위에서 발생하고/거나,
e) 타액의 존재 하에서 발생하는 것
인 단계,
ii) 가온 현탁액을 20 내지 40 min의 기간에 걸쳐 저온살균 온도에서 유지시키는 단계, 및
iii) 단계 ii)에서 유지된 현탁액을 0.5 내지 2℃/min의 온도 변화로 40℃ 미만의 최종 온도로 냉각시키는 단계
를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 살아있지 않은 락토바실러스 조성물을 제
조하는 방법.
청구항 2
제1항에 있어서, 락토바실러스 세포가 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주 세포, 락토바실
러스 람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 세포 또는 그들의 혼합물로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 3
제2항에 있어서, 락토바실러스 세포가 락토바실러스 파라카제이 세포 또는 락토바실러스 람노수스 세포로부터,
바람직하게는 DSMZ 번호 DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 및 DSMZ
16673 중 하나, 또는 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적으로 결합할 수 있는 능력을 보유하는 돌연변이체 또
는 유래된 세포주로부터 선택되는 것인 방법.
청구항 4
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 락토바실러스 세포가 스트렙토코쿠스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523)
및/또는 혈청형 e (NCTC 10923) 및/또는 혈청형 F (NCTC 11060)에 대해 특이적인 결합능을 갖는 것인 방법.
청구항 5
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)의 저온살균 온도가 78 내지 80℃인 방법.
청구항 6
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i) 및/또는 iii)의 온도 변화가 0.8 내지 1.2℃/min인 방법.
청구항 7
제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 i)의 현탁액 배지가 1ℓ 당 10 mmol 이하의 글루코스를 포함하
는 것인 방법.
청구항 8
제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
iv) 단계 iii)에서 수득된 현탁액을 분무 건조 혼합물 제조용 캐리어로 처리하는 단계이며, 여기서 캐리어는 알
칼리 금속 황산염 및 알칼리 토금속 황산염으로부터 선택되고, 캐리어의 양은 분무 건조 현탁액의 건조물 함량
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이 10 내지 30중량%가 되도록 선택되는 것인 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 분무 건조 혼합물을 분무 건조시키는 단계
를 추가로 포함하는 방법.
청구항 9
제8항에 있어서, 건조를 위해 사용되는 분무 건조용 기체의 기체 유입 온도 180 내지 250℃ 및 건조를 위해 제
공되는 구역, 보통은 분무탑으로부터의 기체 배출 온도 70 내지 100℃, 바람직하게는 85℃에서, 건조시키고자
하는 물질의 분무 건조용 기체의 반응 구역 내 평균 체류 시간 10 내지 60초, 바람직하게는 20 내지 40초 동안
분무 건조를 수행하는 방법.
청구항 10
제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 따른 방법에 의해 수득될 수 있거나 또는 수득된, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에
대해 특이적인 결합능을 갖는 락토바실러스 조성물.
청구항 11
제10항에 따른 락토바실러스 조성물을 포함하는 인체용 제품.
청구항 12
제11항에 있어서, 호화 식 제품을 포함한 식 제품, 음료 제품, 반완성 제품, 구강 위생 제품, 화장 제품 및 제
약 제품으로 이루어진 군으로부터 선택되는 제품.
청구항 13
인체용 항우식성 제품을 제조하기 위한 제10항에 따른 락토바실러스 조성물의 용도.
청구항 14
제10항에 따른 조성물 및/또는 제11항 또는 제12항에 따른 제품을 인간의 구강과 접촉시키는 단계를 포함하는,
충치를 예방하는 방법 및/또는 인간 구강으로부터 스트렙토코쿠스 뮤탄스를 제거하는 방법.
명 세 서
기 술 분 야
본 발명은 건강 증진용 제품 및 그의 제조 방법 분야에 관한 것이다.[0001]
배 경 기 술
스트렙토코쿠스 뮤탄스(streptococcus mutans)는 충치 발생에 있어 중요한 역할을 한다. 상기 박테리아는 발효[0002]
성 당을 유기산으로 전환시켜 산성 미세환경을 만든다. 유기산은 법랑질을 탈회시켜 충치 병변을 일으키거나
촉진시킨다. 또한, 에스. 뮤탄스(S. mutans)는 비수용성 글루칸 매트릭스를 생성한다. 이러한 글루칸 매트릭
스는 치아 표면에서의 플라크의 발생과 부착, 및 에스. 뮤탄스의 부착을 지원한다. 추가로, 다른 박테리아들
또한 충치 병변에서 빈번히 발견되지만, 항상 에스. 뮤탄스와 함께 발견된다. 따라서, 에스. 뮤탄스는 현재 충
치 병변의 발생에 있어 필요한 것으로 간주된다.
충치 병변의 발생을 예방할 수 있는 요법이 여전히 요구되고 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 충치 병변의 발[0003]
생을 회피, 중단, 또는 저속화시키기 위한 에스. 뮤탄스에 작용할 수 있는 요법을 제시하고자 하는 것이다. 본
발명은 또한 그러한 요법의 제조 방법을 제시하고자 하는 것이다.
지난 과거에는 충치 병변을 제어하기 위해, 특히 그의 출현을 회피하거나, 또는 적어도 그를 지연시키지 위한[0004]
목적으로 전체적인 일련의 요법이 시험되었다. 당업자는 특히, 치약 및/또는 구강 청정제 및/또는 다른 치아
보호용 제품으로 사용되는 것과 같은, 충치 및 충치 관련 미생물 제어용의 전통적 화학 요법에 대해서는 잘 알
고 있다. 그러나, 추가적으로는 충치 관련 미생물을 다른 미생물 또는 그의 생성물을 통해 제어하고자 하는 시
도, 특히 치아 상에 있거나, 또는 구강에 있는 충치 관련 미생물의 양을 감소시키거나, 또는 다르게는 우식원성
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에도 영향을 미치고자 하는 시도를 해왔다. 그러한 접근법은 예를 들어, WO 2006/027265 A1에 기술되어 있다.
그러나, 그의 단점은, 살아있는 미생물을 구강 관리용 제품에 사용함으로써 빈번하게는 소비자들이 이를 싫어할
수 있거나, 전반적으로는 입법자에 의해 금지된다는 점이다. 또한, 살아있는 미생물이 대사 작용의 결과로 인
해 그를 함유하는 제품의 맛 및/또는 외관에 영향을 줄 수 있으며; 이러한 영향은 충치 병변 제어용의 모든 제
품에 바람직할 수는 없다. 추가로, 충치 병변 제어용 제품에 살아있는 미생물을 사용하는 것이 상기 제품의 저
장 수명을 제한한다.
그러므로, 각종 기술 분야에서 아주 일반적으로는 살아있는 미생물 대신, 대사 작용상 불활성인 미생물을 사용[0005]
하는 것이 시도되었다. 그러나, 여기서, 상기 미생물은 그들에게 적합한 조건 하에서는, 예를 들어, 그들에게
적합한 수성 매질에 이르게 되면, 대사 작용상 활성인 상태로 회복될 수 있다는 점이 문제가 된다. 따라서, 대
사 작용상 불활성인 미생물을 사용한다는 것은 그를 함유하는 가능한 제품 조성물에 심각한 한계들을 수반한다.
그러므로, 아주 다른 기술 분야에서는 살아있거나, 또는 대사 작용상 활성인 미생물 대신 파괴된 미생물을 사용[0006]
하여 제품을 제조하는 것이 시도되어 왔다. 따라서, 예를 들어, WO 01/95741 A1에는 생존 불능의 락토바실리
(Lactobacilli)를 함유하는 식 제품인 장 균형 촉진용 식 제품이 제시되어 있다. 열 처리, 예를 들어, 저온살
균 또는 멸균을 통해 락토바실리를 생존 불능으로 만들 수 있다. 그러나, 상기 문헌에서는 다르게는 달성될 수
있는 미생물의 일부 건강 증진 효과도 열 처리 결과로 인해 상실될 위험이 있다는 것도 언급하였다. 상기 문헌
에서 이러한 건강 증진 효과가 "선택적으로" 제거될 수 있다고 언급은 하였지만, 미생물 열 처리 동안 발생할
수 있는 원하는 건강 증진 특징의 상실을 막을 수 있는 방법에 대해서는 사실상 교시하지는 않았다. 그러므로,
상기 문헌에 비추어 볼 때, 당업자는 의미있는 방식으로 미생물 열 처리 결과로 인해 어떤 건강 증진 효과가 상
실되는지 및 그렇지 않은지에 관해 예측할 수도, 추측할 수도 없다. 특히, 항우식성 효과가 열 처리 결과로 인
해 상실되는지 여부를 예측 또는 예상할 수 없다.
발명의 내용
해결하려는 과제
그러므로, 본 발명의 목적은 충치 병변을 제어하기 위한 요법, 특히, 충치 병변의 발생을 회피 또는 지연시키기[0007]
위한 요법을 제시하고자 하는 것이다. 특히, 요법은 원하는 효과가 일어날 수 있도록 보장하도록 하는 것이다.
그의 제조 방법은 간단하고 저렴하며, 가능할 경우, 상기 기술된 단점을 회피하거나 또는 심각하지 않은 수준으
로 감소시키고자 한다.
과제의 해결 수단
그러므로, 본 발명에 따라, [0008]
i) 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 락토바실러스(Lactobacillus) 또는 락토바실리 혼합[0009]
물 세포 현탁액을 0.5 내지 2℃/min의 온도 변화로 40℃ 미만의 출발 온도로부터 75 내지 85℃의 저온살균 온도
로 가온시키고, 여기서, 특이적인 결합은
a) 열 처리에 내성을 띠고/거나,[0010]
b) 프로테아제 처리에 내성을 띠고/거나,[0011]
c) 칼슘에 의존성이고/거나, [0012]
d) pH 4.5 내지 8.5 범위에서 발생하고/거나,[0013]
e) 타액의 존재 하에서 발생하는 것[0014]
인 단계,[0015]
ii) 20 내지 40 min의 기간에 걸쳐 상기 가온 현탁액을 저온살균 온도에서 유지시키는 단계, 및[0016]
iii) 단계 ii)에서 유지된 현탁액을 0.5 내지 2℃/min의 온도 변화로 40℃ 미만의 최종 온도로 냉각시키는 단계[0017]
를 포함하는, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 살아있지 않은 락토바실러스 제제를 제조[0018]
하는 방법을 제시한다.
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발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
상기 락토바실리는 WO 2006/027265 A1에 개시되어 있으며, 상기 문헌은 본 발명의 개시 목적으로 그의 전문이[0019]
본원에 참조로 포함된다.
놀랍게도, 전반적으로 또는 본질적으로 대사 작용상 활성인 살아있는 락토바실리 미생물을 함유하지 않으며, 동[0020]
시에 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해서는 여전히 특이적인 결합능을 갖는 제제는 본 발명에 따른 방법의 단계에
서 기술된 바와 같은 온화한 조건 하에서의 저온살균을 통해 본 발명에 따라 선택된 락토바실리에 의해 성공적
으로 제조될 수 있는 것으로 밝혀졌다. 그러므로, 본 발명에 따라 제조된 제제는 항우식성 효과를 발휘하는 데
적합하며, 따라서, 충치 예방 및/또는 치료용 요법제로서 유용하다. "충치" 및 "충치 병변"이라는 용어는 본
명세서의 범주 내에서 상호교환적으로 사용되며, 이는 치아 상에 또는 치아 내의 연화된 패치의 발생에 의해 식
별되고, 점차적으로 진행되어 치아를 소실시키는 만성 감염성 질환을 의미한다. 충치는 공지된 방법에 의해 진
단할 수 있으며; 당업자는 그러한 목적으로 예를 들어, 논문 [Angmar-Mansson and ten Bosch, Adv. Dent. Res.
7 (1993), 70 내지 79]을 참조할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, "충치 제어" 또는 "충치 병변 제어"라는 용어는 충치 예방을 포함한다. 그러므로, 본[0021]
발명에 따라 제조된 다른 조성물도 이들 조성물이, 임의적으로 도입되는 에스. 뮤탄스 세포에 결합하여 이러한
방식으로 상기 세포의 제거를 촉진시킬 수 있는 한, 에스. 뮤탄스를 구강 내에 함유하지 않는 것이 틀림없는 대
상에게도 유익할 수 있다.
본 발명의 목적을 위해, "충치 치료"라는 용어는 또한 에스. 뮤탄스 세포의 양을 감소시키기 위한 목적으로, 및[0022]
적절한 경우, 입으로부터, 특히, 치아와 치간강을 포함하는 전체 구강으로부터 에스. 뮤탄스를 완벽하게 제거하
기 위해 충치를 앓는 환자에게 본 발명에 따라 제조된 조성물을 투여하는 것을 포함한다.
에스. 뮤탄스에 결합할 수 있는 능력과 관련하여, 본 발명에 따라 선택되는 미생물은 열 안정성이 높다. 이로[0023]
써, WO 2006/027265 A1에서 살아있는 락토바실러스 세포에 대해 기술된 바 있는 에스. 뮤탄스에의 결합의 건강
증진 효과는 심지어 본 발명에 따른 저온살균 후에도 상실되지 않고 유지될 수 있다. 이는 특히 드문 일인데,
그 이유는 미생물일 경우, 이론상으로는 예를 들어, 상당량의 미생물 단백질이 저온살균시 변성되며 다른 세포
구성 성분들은 용해되거나 손상됨으로써 미생물의 건강 증진 효과가 저온살균 이후에 상실될 것이 주로 예상되
기 때문이다. 사실상, 상기 언급한 WO 01/95741 A1에는 단지 특정의 락토바실리가 저온살균에도 불구하고 장내
세균총에 대해 건강 증진 효과를 발휘할 수 있다고 제시되어 있다. 그러나, 구조, 내용물, 및 용도면에
있어서, 구강은 장과는 전적으로 다른 바, 이에 당업자는 마지막으로 언급했던 문헌에서의 발견 내용을 본 발명
에 적용시킬 수 없다.
따라서, 본 발명의 추가의 측면에 따르면, 본 발명에 따른 제조 방법에 의해 수득될 수 있거나, 수득된, 스트렙[0024]
토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 락토바실러스 조성물을 제시한다. 상기 조성물을 통해 본 발
명에 따른 제조 방법의 상기 기술된 이점들이 실현되며, 이는 특히, 인체용 항우식성 제품을 제조하는 데 적합
하다.
락토바실러스 세포는 바람직하게 락토바실러스 파라카제이(Lactobacillus paracasei) 균주 세포, 락토바실러스[0025]
람노수스(Lactobacillus rhamnosus) 균주 세포 또는 그들의 혼합물로부터 선택된다. 따라서, 본 발명에 따른
제조 방법은 락토바실러스 균주, 특히, 락토바실러스 파라카제이 균주 또는 락토바실러스 람노수스 균주의 순수
한 배양물 현탁액 뿐만 아니라, 2, 3, 4, 5, 6, 7개 이상의 균주로 이루어진 혼합물을 사용함으로써 수행될 수
있다. WO 2006/027265 A1에서 언급된 락토바실러스 종 및 균주, 특히, 각각 도이췌 삼룽 퓌어 미크로오르가니
즈멘 운트 젤쿨투렌(Deutsche Sammlung fuer Mikroorganismen und Zellkulturen: 독일 브라운쉬바이크 마쉐호
더 비그 1베)에 2004년 8월 26일자로 기탁된 DSMZ 번호 DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670,
DSMZ 16671, DSMZ 16672 및 DSMZ 16673 중 하나인 것이 본 발명에 따른 방법에 특히 바람직하다. 락토바실러
스 세포가 본 발명의 범주 내에서 언급되는 한, 이는 또한 적어도 바람직하게는 상기 언급된 균주 세포 및 상기
언급된 균주 중 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 균주로 이루어진 혼합물을 의미하는 것으로 이해되어야 한다. 당업
자는 상기 언급된 균주들 중 한 세포 대신, 또는 그 이외에도, 에스. 뮤탄스에 대해 특이적으로 결합할 수 있는
능력을 보유하는 것인 돌연변이체 또는 유래된 세포주 또한 본 발명에 따른 방법에서 사용할 수 있다는 것을 이
해할 것이다.
락토바실러스 세포는 바람직하게 스트렙토코쿠스 뮤탄스 혈청형 c (DSMZ 20523) 및/또는 혈청형 e (NCTC 10923)[0026]
및/또는 혈청형 F (NCTC 11060)에 대해 특이적인 결합능을 갖는다.
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돌연변이체, 특히, 상기 언급된 락토바실러스 균주 중 하나의 돌연변이체는 하나 이상의 영구적으로 유전되는[0027]
변형, 보통은 그의 핵산(들)을 갖는다. 그러한 변형은 보통 점 돌연변이, 예를 들어, 전이 또는 전환 뿐만 아
니라, 핵산을 이루는 하나 이상의 염기의 결실, 삽입, 및 부가도 포함하며, 이로써 핵산은 변형되고, 정상에서
벗어나는 유전자 발현 및/또는 전사 및/또는 번역, 또는 유전자 생성물의 불활성화가 일어난다. 돌연변이는 자
발적으로 일어날 수 있거나, 또는 작용 물질, 예를 들어, 화학 물질 또는 방사선 조사에 의해 유발될 수 있다.
돌연변이체 및 유래된 세포주를 선택하고 수득하는 방법은 예를 들어, 문헌 [Sambrook, "Molecular cloning, a
laboratory manual," Cold Spring Harbor Laboratory, NY, (2001)] 및 [Ausubel, "Current protocols in
molecular biology," Green Publishing Associates and Wiley Interscience NY, (1989)]에 기술되어 있다.
당업자는 추가 정보에 대해서 WO 2006/027265 A1에서 찾을 수 있을 것이다.
본 발명의 목적을 위해, "특이적인 결합" 또는 "특이적인 결합능"이란 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해서, 본 발[0028]
명에 따라 사용되는 락토바실러스 세포, 또는 본 발명에 따라 저온살균된 세포가 에스. 뮤탄스에는 결합하지만,
보통 구강내 상당량으로 존재하는 그 나머지의 다른 미생물들 대부분, 또는 그들 모두에 결합하지 않는다는 것
을 의미한다. 본 발명에 따라 선택된 미생물은 바람직하게는 스트렙토코쿠스 살리바리우스(Streptococcus
salivarius), 스트렙토코쿠스 살리바리우스 써모필루스(Streptococcus salivarius thermophilus), 스트렙토코
쿠스 오랄리스(Streptococcus oralis), 스트렙토코쿠스 미티스(Streptococcus mitis) 및/또는 스트렙토코쿠스
상귀니스(Streptococcus sanguinis) 세포에는 결합하지 않는다. 본 발명에 따라 사용되는 락토바실러스 세포는
특히 바람직하게 스트렙토코쿠스 살리바리우스 아종 써모필루스(Streptococcus salivarius ssp. thermophilus)
API 50 CH (바이오메리옥스(Biomerieux: 프랑스)), 스트렙토코쿠스 오랄리스 DSMZ 20066, 스트렙토코쿠스 오랄
리스 DSMZ 20395, 스트렙토코쿠스 오랄리스 DSMZ 20627, 스트렙토코쿠스 미티스 DSMZ 12643 및/또는 스트렙토코
쿠스 상귀니스 DSMZ 20567에는 결합하지 않는다. 유사하게, 본 발명에 따라 사용되는 락토바실러스 세포가 스
트렙토코쿠스 이외의 속에 속하는 박테리아에는 결합하지 않는 경우, 즉, 예를 들어, 스타필로코쿠스
(Staphylococcus) 속의 세포에는 결합하지 않는 경우가 바람직하다. 특히 바람직하게는 스타필로코쿠스 에피데
르미디스(Staphylococcus epidermidis) DSMZ 1798 및/또는 로코쿠스 에피데르미디스 DSMZ 20044에는 결합하지
않는다. 상기 결합능을 시험하기 위해, 당업자는 상기 언급된 박테리아를 본 발명에 따라 선택된 락토바실리,
또는 본 발명에 따라 저온살균된 그 나머지와 3:1의 부피비로 혼합하고, 락토바실러스에 의해 일어나는 임의의
응집을 관찰함으로써 WO 2006/027265 A1에 기술된 바와 같이 진행하였다. 적합한 방법은 상기 언급된 WO 명세
서 실시예 3에 기술되어 있다.
따라서, 제1 단계에서 바람직한 락토바실러스 균주, 특히, 엘. 파라카제이(L. paracasei) 또는 엘. 람노수스(L.[0029]
rhamnosus) 중 하나 이상, 및 바람직하게는 균주 DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ
16671, DSMZ 16672 및 DSMZ 16673 중 하나 이상의 세포, 및 특히 바람직하게는 적어도 DSM 16671 및/또는 상기
기술된 하나의 돌연변이체 또는 유래된 세포주를 현탁액 중에서 0.5 내지 2℃의 온도 변화로 40℃ 미만의 출발
온도로부터 75 내지 85℃의 저온살균 온도로 가온시키고, 제2 단계에서 20 내지 40 min (저온살균 시간) 동안
저온살균 온도에서 유지시키고, 이어지는 제3 단계에서 상기 현탁액을 0.5 내지 2℃의 온도 변화로 40℃ 미만의
최종 온도로 냉각시키는 본 발명에 따른 방법이 바람직하다.
단계 i)의 저온살균 온도는 바람직하게는 78 내지 80℃, 특히 바람직하게는 80℃이다. 상기와 같은 저온살균[0030]
온도를 사용하게 되면, 저온살균되지 않은 살아있는 락토바실러스 세포 배양물과 비교하였을 때, 결합능을 거의
상실하지 않으면서 동시에, 신속하게, 이로써 에너지 절약형으로, 추가로는 안전하게 본 발명에 따라 선택된 락
토바실러스 세포를 성공적으로 파괴시킬 수 있다.
저온살균 시간은 바람직하게는 25 내지 35 min이고, 특히 바람직하게는 30 min이다. 특히, 저온살균 온도가 78[0031]
내지 80℃ (바람직하게는 80℃)일 경우, 살아있는 락토바실러스 세포 배양물과 비교하였을 때, 에스. 뮤탄스에
의 결합능은 최소한도로 상실시킴과 동시에 본 발명에 따라 선택된 락토바실러스 세포를 신속하게 파괴시킬 수
있는 것으로 밝혀졌다.
유사하게, 단계 i) 또는 iii)의 온도 변화는 0.8 내지 1.2℃/min, 바람직하게는 1℃/min인 것이 바람직하다.[0032]
이러한 방식으로, 락토바실러스 세포의 파괴 위험없이, 또는 에스. 뮤탄스에 대한 결합능의 막대한 상실을 수용
해야 할 필요없이 저온살균 온도 도달까지의 가열 시간은 이롭게도 단기간으로 유지될 수 있으며, 이로써 에너
지는 절약될 수 있다.
또한, 제1 단계에서 바람직한 락토바실러스 균주, 특히, 엘. 파라카제이 또는 엘. 람노수스 중 하나 이상의 세[0033]
포 및 바람직하게는 균주 DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 및 DSMZ
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16673 중 하나 이상의 세포 및 특히 바람직하게는 적어도 DSM 16671 및/또는 상기 기술된 하나의 돌연변이체 또
는 유래된 세포주를 현탁액 중에서 0.8 내지 1.2℃, 바람직하게는 1℃의 온도 변화로 40℃ 미만의 출발 온도로
부터 78 내지 80℃, 바람직하게는 80℃의 저온살균 온도로 가온시키고, 제2 단계에서 25 내지 35 min 및 바람직
하게는 30 min (저온살균 시간) 동안 저온살균 온도에서 유지시키고, 이어지는 제3 단계에서 상기 현탁액을 0.8
내지 1.2℃, 바람직하게는 1℃의 온도 변화로 40℃ 미만의 최종 온도로 냉각시키는 본 발명에 따른 방법이 특히
바람직하다.
본 발명에 따라 저온살균되는 세포는 대수 증식기 이후인 것이 바람직하다. 본 발명에 따른 제조 방법 중 단계[0034]
i)에서는 초기에는 대수 증식을 허용하지만, 그 중의 글루코스 농도가 1 mM 글루코스 이하인 값으로 하락하는
것인 배양 배지로부터의 세포를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 여기서, 그의 글루코스 농도가 1 h 이하인 기
간 동안 1 mM 글루코스 이하인 값으로 하락하는 것인 세포를 사용하는 것이 바람직한데, 그 이유는 본 발명에
따른 제조 방법의 생성물, 즉, 단계 iii), 적절할 경우, 본원 하기에서 기술하는 세척 단계 또는 분무 건조 단
계의 결과물의 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 특이적으로 결합할 수 있는 능력의 상실이 시작되기 때문이다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 단계 (iii)에서 수득된 현탁액을 원심분리하여 저온살균된 세포를 농축시[0035]
키고, 그렇게 수득된 농축된 세포를 물로 처리하고, 다시 원심분리하여 세포를 다시 농축시키는 것인 세척 단계
를 추가로 포함한다. 수득된 농축된 세포는 물질의 건조물 함량이 10 내지 30중량%, 바람직하게는 18 내지 22
중량%인 물질로서 존재한다.
(특히, 락토바실러스 균주 DSM 16667, DSM 16668, DSM 16669, DSM 16670, DSM 16671, DSM 16672 및 DSM 16673,[0036]
또는 상기 기술된 돌연변이체 또는 세포주, 또는 엘. 파라카제이 또는 엘. 람노수스 균주 중 하나, 또는 2, 3,
4, 5, 6, 또는 7개의 균주로 이루어진 혼합물에 적용되는) 단계 i) 내지 iii) 이외에도, 적절할 경우, 세척이
하기 단계:
iv) 단계 iii)에서 수득된 현탁액을 분무 건조 혼합물 제조용 캐리어로 처리, 바람직하게는 세척하는 단계이며,[0037]
여기서, 캐리어는 알칼리 금속 황산염 및 알칼리 토금속 황산염, 바람직하게는 황산나트륨, 황산칼륨 또는 황산
칼슘, 및 이들 황산염 중 2개 이상의 혼합물로부터 선택되고, 캐리어의 양은 분무 건조 혼합물의 건조물 함량이
10 내지 30중량%가 되도록 선택되는 것인 단계, 및
v) 단계 iv)에서 수득된 분무 건조 혼합물을 분무 건조시키는 단계[0038]
를 포함하는 방법이 본 발명에 따라 특히 바람직하다. [0039]
분무 건조는 물질이 건조되도록 매우 가혹한 조건, 및 특히, 예를 들어, 70℃ 내지 200℃의 온도에 노출시키는[0040]
것이다. 본 발명에 따라 선택된 락토바실러스 세포가 에스. 뮤탄스에 대한 특이적인 결합능의 상당한 상실없이
분무 건조 동안 발생되는 가혹한 조건을 견딜 수 있는지 여부에 대해서는 심지어 상기 락토바실러스 세포를 통
해서도 알지 못했다. 게다가, 단계 iv)의 캐리어가 본 발명에 따라 다량으로 존재할 경우, 에스. 뮤탄스에의
추가 결합을 담당하는 락토바실러스 표면의 구조는 변성되거나, 또는 다르게는 손상될 것으로 예상된다. 놀랍
게도, 현재 에스. 뮤탄스에 대한 결합능의 상당한 상실없이, 단계 iii)에서 수득된 현탁액을 선택된 조건 하에
서 분무 건조시킬 수 있는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 분무 건조 방법, 및 그에 따라 제조된 본 발명에 따른 분무 건조된 조성물의 몇가지 이점은 특[0041]
히 주목할 가치가 있다: 간단한 저온살균과는 달리, 본 발명에 따른 분무 건조를 통해 비점착성 또는 흡습성 조
성물을 수득할 수 있다. 이와 관련하여, 흡습성이란 온도 20℃ 및 상대 습도 50% 하에서 12개월이라는 기간에
걸쳐 개방형으로 저장하였을 때, 조성물의 중량이 2% 이하만큼 증가하였다는 것을 의미하는 것이다. 따라서,
그렇게 제조된 본 발명에 따른 조성물은 특히 건식 제품으로 프로세싱되는 데 적합하고; 물 흡수 또는 특별히
점착성이라는 이유로 상기 제품의 특성에 불리한 영향을 미치지 않을 것이다.
본 발명에 따른 제조 방법을 통해서는 자유-유동성인, 본 발명에 따른 조성물을 추가로 제조할 수 있다. 입자[0042]
성, 자유-유동성 조성물은 특히 쉽게 저장 및 프로세싱될 수 있고, 이는 매우 정확하게 투여될 수 있으면서, 동
시에 매우 광범위한 제품에 도입될 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 분무 건조 방법에 의해 수득된, 본 발명
에 따른 조성물은 경제적으로 중요한 규모로 단계 iii) 후에 바로 수득되는 현탁액보다 더욱더 광범위한 제품
영역에 도입될 수 있다.
단계 iv)에서 캐리어로서 특히 바람직한 것으로 황산나트륨이다. 캐리어, 특히 바람직하게는 황산나트륨의 양[0043]
은 단계 iii)으로부터 사용되는 현탁액의 건조물의 배가되는 양이 된다. 이 경우, 단계 v)에서의 분무 건조를
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위해 사용되는 분무 건조 혼합물은 대략 20중량%의 총 건조물을 함유할 것이다.
단계 v)에서 분무 건조는 바람직하게 건조를 위해 사용되는 분무 건조용 기체의 기체 유입 온도 180 내지 250℃[0044]
및 건조를 위해 제공되는 구역, 보통은 분무탑으로부터의 기체 배출 온도 70 내지 100℃, 바람직하게는 85℃에
서 건조시키고자 하는 물질의 분무 건조용 기체의 반응 구역 내 평균 체류 시간 10 내지 60초, 바람직하게는 20
내지 40초 동안 수행된다. 당업자는 추가로 WO 01/25411 A1에 제공된 정보로부터 분무 건조에 관한 지침을 취
할 수 있다. 상기 문헌에는 분무 건조된 효소 생성물을 제조하는 일반적으로 적합한 분무 건조 방법이 기술되
어 있다. 놀랍게도, 현재는 심지어 본 발명에 따라 바람직한 보다 고온인 온도에서조차 에스. 뮤탄스에 대한
결합능의 상당한 상실없이도 분무 건조할 수 있는 것으로 밝혀졌다. 이는 WO 01/25411 A1을 기반으로 하여 예
상할 수 있는 사실이 아닌데, 그 이유는 특히 상기 문헌에서는 저온살균 이후에 수행되는 실행 분무 건조 단계
의 간단한 일례가 기술되어 있지 않고, 또한 당업자는 추정컨대 매우 광범위한 부류의 효소에 대한 분무 건조의
적합성에 관하여 상기 문헌을 추측에 근거한 것으로 간주하기 때문이다.
그러므로, 특히 바람직한 본 발명에 따른 방법은[0045]
i) 제1 단계에서 상기 기술된 대수 증식기 이후의 것인, 바람직한 락토바실러스 균주, 특히, 엘. 파라카제이 또[0046]
는 엘. 람노수스 중 하나 이상의 세포, 및 바람직하게는 균주 DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ
16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 및 DSMZ 16673 중 하나 이상의 세포, 및 특히 바람직하게는 적어도 DSM 16671
및/또는 하나의 돌연변이체 또는 유래된 세포주를 현탁액 중에서 0.8 내지 1.2℃, 바람직하게는 1℃의 온도 변
화로 40℃ 미만의 출발 온도로부터 78 내지 80℃, 바람직하게는 80℃의 저온살균 온도로 가온시킨 후, 이어서,
(ii) 25 내지 35 min 및 바람직하게는 30 min 동안 상기 현탁액을 저온살균 온도에서 유지시킨 후, 이어서,[0047]
(iii) 0.8 내지 1.2℃, 바람직하게는 1℃의 온도 변화로 상기 현탁액을 40℃ 미만의 최종 온도로 냉각시킨 후,[0048]
이어서, 상기 기술된 바와 같이 물로 세척하고, 원심분리에 의해 건조물 함량이 10 내지 30중량%, 바람직하게는
18 내지 22중량%가 되도록 만든 후, 이어서,
(iv) 현탁액을 분무 건조 혼합물 제조용 캐리어로 처리하며, 여기서, 캐리어는 황산나트륨, 황산칼륨 및 황산칼[0049]
슘, 및 이들 중 2개 이상의 혼합물로부터 선택되고, 특히 바람직하게는 황산나트륨이고, 캐리어의 양은 분무 건
조 혼합물의 건조물 함량이 10 내지 30중량%가 되도록 선택되고, 이어서,
(v) 단계 (iv)에서 수득된 캐리어-함유 현탁액을 건조를 위해 사용되는 분무 건조용 기체의 기체 유입 온도 180[0050]
내지 250℃ 및 건조를 위해 제공되는 구역, 보통은 분무탑으로부터의 기체 배출 온도 70 내지 100℃, 바람직하
게는 85℃에서 건조시키고자 하는 물질의 분무 건조용 기체의 반응 구역 내 평균 체류 시간 10 내지 60초, 바람
직하게는 20 내지 40초 동안 분무 건조시키는 것인 한 방법이다.
본 방법을 통해 본 발명의 상기 기술된 이점들이 실현된다.[0051]
단계 i) 내지 iii), 및 임의로 iv) 내지 v)를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있거나 또는 수득된, 스트렙토코[0052]
쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 본 발명에 따른 락토바실러스 조성물은 바람직하게 인체용 제품에
혼입된다. 특히, 구강 내로 도입하고/거나, 치아와 접촉시킴으로써 인체용으로 사용하는 경우, 사실상 본 발명
에 따른 조성물을 사용함으로써 충치를 예방할 수 있다.
본 발명에 따른 제품은 편의상 에스. 뮤탄스에의 결합에 및/또는 항우식성 효과를 수득하는 데 충분한 양으로[0053]
본 발명에 따른 조성물을 포함한다. 이러한 양은 해당 제품의 성질 및 그의 제약상 제시에 따라 달라진다. 특
히, 상기 양은 또한 에스. 뮤탄스에의 가능한 결합 또는 가능한 항우식성 효과의 특별히 바람직한 정도에 따라
달라진다. 제품에 따라, 당업자는 통상의 실험을 통해 효과의 바람직한 정도, 제품의 성질 및 제약상 제시와
관련하여 충분한 것인, 본 발명의 따른 조성물의 양을 쉽게 결정할 수 있을 것이다. 특히, 당업자는 제품이 본
발명에 따른 조성물로 코팅될 수 있거나, 혼합에 의해 상기 조성물이 혼입될 수 있다는 것을 고려할 것이다.
본 발명에 따른 제품은 바람직하게는 식 제품 (호화 식 제품 포함), 음료 제품, 반완성 제품, 구강 위생 제품,[0054]
화장 제품 및 제약 제품으로 이루어진 군으로부터 선택된다. 상응하는 제품은 WO 2006/027265 A1에 기술되어
있다.
특히 바람직한 제품은 츄잉 껌, 치약, 구강 세정제 및 로젠지이다.[0055]
본원 하기에서 본 발명은 실시예를 참조로 하여 기술되지만, 실시예가 본 특허청구범위의 보호하고자 하는 범주[0056]
를 제한하고자 하는 것은 아니다.
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실시예 1: 일반 제조 방법[0057]
특이적인 결합이[0058]
a) 열 처리에 내성을 띠고/거나,[0059]
b) 프로테아제 처리에 내성을 띠고/거나,[0060]
c) 칼슘에 의존성이고/거나, [0061]
d) pH 4.5 내지 8.5 범위에서 발생하고/거나,[0062]
e) 타액의 존재 하에서 발생하는 것인, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 락토바실러스 세[0063]
포를 37℃에서 적합한 수성 영양 배지 중에서 배양하였다. 적합한 영양 배지는 글루코스, 효모 추출물, 트윈
(Tween) 80 및 염을 함유하였다. 유가식 작동으로 수성 현탁액으로 배양을 수행하였다.
영양 배지 중 글루코스의 함량이 1 mM 아래로 하락하자마자, 또는 상기 시점 후 최대 1시간까지, 현탁액을 75[0064]
내지 85℃, 바람직하게는 78 내지 80℃의 저온살균 온도로 가온시켰다. 이와 관련하여, 현탁액을 0.5 내지 1.2
℃/min, 바람직하게는 0.8 내지 1.2℃/min의 온도 변화로 가온시켰다.
20 내지 40분, 바람직하게는 25 내지 35분 및 특히 바람직하게는 30분 동안 상기 가온 현탁액을 저온살균 온도[0065]
에서 유지시켰다.
이어서, 현탁액을 40℃ 미만의 온도로 냉각시켰다. 이와 관련하여, 온도 변화는 0.5 내지 2℃/min, 바람직하게[0066]
는 0.8 내지 1.2℃/min이었다.
이어서, 냉각된 현탁액을 원심분리에 의해 건조물 함량이 10 내지 30중량%가 되도록 농축시켰다. 그렇게 수득[0067]
된 농축물을 물에 다시 재현탁시키고, 다시 원심분리에 의해 건조물 함량이 10 내지 30중량%가 되도록 재농축시
켰다. 재현탁 및 농축은 최대 총 8회에 걸쳐 수행하였다. 최종적으로, 건조물 함량이 10 내지 30중량%인 세척
된 바이오매스를 수득하였다.
상기 바이오매스는 본 실시예 처음에 기술한 바와 같은 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적으로 결합할 수 있[0068]
는 능력을 여전히 보유하였다. 충치 제어용 제품을 갖추도록 준비하기 위해, 또는 이미 존재하고 있는 그의 충
치 제어능을 지원하기 위해 상기 바이오매스는 그 자체로서 식 제품 (호화 식 제품 포함), 음료 제품, 반완성
제품, 구강 위생 제품, 화장 제품 또는 제약 제품 내로 혼입될 수 있다.
실시예 2: 구강 관리용 조성물 제조[0069]
본 발명에 따라 정의된, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 엘. 파라카제이 또는 엘. 람노[0070]
수스 배양물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하고, 저온살균하고, 세척하였다. 저온살균 온도는 80℃였다.
저온살균 시간은 30 min이었다. 온도 변화는 각 경우에 0.8 내지 1.2℃/min이었다. 1차 원심분리 후에 수득된
농축된 현탁액은 물을 첨가하여 재현탁액의 건조물 함량이 5중량%가 되도록 재현탁시켰다. 그렇게 수득된 재현
탁액을 건조물 함량이 20중량%가 되도록 재원심분리시켰다.
그렇게 수득된 세척 및 농축된 바이오매스를 수성 캐리어 및 향미제로 처리하였다. 이로써 충치 제어용 구강[0071]
세정제를 수득하였다.
동일한 방식으로, DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 또는 DSMZ[0072]
16673을 사용하여 제조된 세척 및 농축된 바이오매스를 수득하였다. 유사하게, 각 경우에 상기 바이오매스를
수성 캐리어 및 향미제로 처리하여 각 경우에 충치 제어용 구강 세정제를 수득하였다.
각각의 세척 및 농축된 바이오매스를 츄잉 껌 베이스, 치약 베이스 및 로젠지 베이스 내로 혼입시키고, 원하는[0073]
향미제를 첨가함으로써 구강 세정제 대신 충치 제어용 츄잉 껌, 치약 및 로젠지를 제조하였다.
실시예 3: 일반 분무 건조 방법[0074]
10 내지 30% 농도의 알칼리 및/또는 알칼리토 황산염 수용액을 제조함으로써 염기성 분무 건조용 용액을 제조하[0075]
였다. 분무 건조 혼합물을 제조하기 위해, 실시예 1에 기술된 바와 같이 수득된 세척 및 농축된 바이오매스를
4배량의 염기성 분무 건조용 용액 중에 재현탁시켜 100 유니트 부피의 바이오매스로부터 500 유니트 부피의 분
무 건조 혼합물을 수득하였다.
분무 건조탑으로 도입시켜 분무 건조 혼합물을 분무 건조시켰다. 분무 건조탑 내로의 유입 온도는 180 내지[0076]
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250℃이고, 분무 건조탑으로부터의 배출 온도는 70 내지 100℃인 분무 건조용 기체로 분무 건조탑을
충전시켰다. 분무 건조 혼합물의 분무 건조탑 내 평균 체류 시간은 60초 이하였다.
수득된 분무 건조된 물질은 실시예 1의 처음에 기술한 바와 같은 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적으로 결[0077]
합할 수 있는 능력을 여전히 보유하였다. 충치 제어용 제품을 갖추도록 준비하기 위해, 또는 이미 존재하고 있
는 그의 충치 제어능을 지원하기 위해 생성된 분무 건조된 물질은 그 자체로서 식 제품 (호화 식 제품 포함),
음료 제품, 반완성 제품, 구강 위생 제품, 화장 제품 또는 제약 제품 내로 혼입될 수 있다.
실시예 4: 추가의 구강 관리용 조성물 제조[0078]
본 발명에 따라 정의된, 스트렙토코쿠스 뮤탄스에 대해 특이적인 결합능을 갖는 엘. 파라카제이 또는 엘. 람노[0079]
수스 배양물을 실시예 1에 기술된 바와 같이 배양하고, 저온살균하고, 세척하였다. 저온살균 온도는 80℃였다.
저온살균 시간은 30 min이었다. 온도 변화는 각 경우에 0.8 내지 1.2℃/min이었다. 1차 원심분리 후에 수득된
농축된 현탁액은 물을 첨가하여 재현탁액의 건조물 함량이 5중량%가 되도록 재현탁시켰다. 그렇게 수득된 재현
탁액을 건조물 함량이 20중량%가 되도록 재원심분리시켰다.
이어서, 실시예 3에 기술된 바와 같은 분무 건조법으로 재현탁액을 분무 건조시켰다. 염기성 분무 건조용 용액[0080]
은 20% 농도의 황산나트륨 수용액이었다. 분무 건조용 기체의 분무탑 내로의 유입 온도는 180-250℃였다. 분
무 건조용 기체의 분무탑으로부터의 배출 온도는 70-100℃였다. 분무 건조 혼합물의 분무탑 내 평균 체류 시간
은 10초였다.
이로써 분무 건조된 물질을 수득하였다. 분무 건조된 물질을 수성 캐리어 및 향미제로 처리하였다. 이로써,[0081]
충치 제어용 구강 세정제를 수득하였다.
동일한 방식으로, DSMZ 16667, DSMZ 16668, DSMZ 16669, DSMZ 16670, DSMZ 16671, DSMZ 16672 또는 DSMZ[0082]
16673을 사용하여 분무 건조된 물질을 제조하였다. 유사하게, 상기 물질을 또한 수성 캐리어 및 향미제로 처리
하여 각 경우에 충치 제어용 구강 세정제를 수득하였다.
각각의 물질을 츄잉 껌 베이스, 치약 베이스 및 로젠지 베이스 내로 혼입하고, 원하는 향미제를 첨가함으로써[0083]
구강 세정제 대신 충치 제어용 츄잉 껌, 치약 및 로젠지를 제조하였다.
공개특허 10-2012-0112452
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