표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 DNA 단편의 특이적 제작 방법(Specific method for preparing joined DNA fragments including sequences derived from target genes)

(19) 대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(11) 공개번호 10-2013-0029460
(43) 공개일자 2013년03월22일
(51) 국제특허분류(Int. Cl.)
C12N 15/10 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01)
C12Q 1/68 (2006.01)
(21) 출원번호 10-2012-7008688
(22) 출원일자(국제) 2010년09월02일
심사청구일자 없음
(85) 번역문제출일자 2012년04월03일
(86) 국제출원번호 PCT/JP2010/064994
(87) 국제공개번호 WO 2011/027808
국제공개일자 2011년03월10일
(30) 우선권주장
JP-P-2009-205308 2009년09월04일 일본(JP)
(71) 출원인
내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티 오브
토야마
일본 930-8555, 토야마, 토야마-시, 고후쿠, 3190
(72) 발명자
쿠로사와, 노부유키
일본, 9308555, 토야마, 토야마-시, 고후쿠,
3190, 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티
오브 토야마, 사이어스 앤드 엔지니어링 리서치
섹션 내
이소베, 마사하루
일본, 9308555, 토야마, 토야마-시, 고후쿠,
3190, 내셔날 유니버시티 코포레이션 유니버시티
오브 토야마, 사이어스 앤드 엔지니어링 리서치
섹션 내
(74) 대리인
청운특허법인
전체 청구항 수 : 총 44 항
(54) 발명의 명칭 표적 유전자 유래 배열을 포함한 연결 ＤＮＡ 단편의 특이적 제작 방법
(57) 요 약
본 발명은, 임의의 표적 유전자에서, 표적 유전자 배열을 포함한 DNA 단편의 정제의 유무에 관계없이, 표적 유전
자 단편만을 목적으로 하는 다른 DNA 단편과 결합시킨 「연결 DNA 단편」을 선택적으로 얻는 방법을 제공하는 것
을 목적으로 한다. 본 발명은 배열(A) 및 배열(B), 또는 배열(A) 또는 배열(B)를 포함한 연결용 2중 가닥 DNA 단
편을, 표적 유전자 단편의 각 말단 측에 선택적으로 연결시키는 방법에 관한 것이다. 소정의 관계에 있는 3＇말
단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하여 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편
및 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 혼합물을, 적어도 2 사이클의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 제공하고,
상기 배열(A), 상기 표적 유전자의 배열 및 상기 배열(B)가 연결된 1단위의 배열을 1개 이상 포함한 2중 가닥
DNA 단편인 「연결 DNA 단편」을 얻는다. 유사한 방법으로, 「편측 연결 DNA 단편」도 얻어진다.
대 표 도 - 도1
공개특허 10-2013-0029460
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특허청구의 범위
청구항 1
표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법에서,
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에서부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지고, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단
편을 준비하며,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
의 한쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열
이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이고,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반
응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않으며,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단
편의 다른쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의
배열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않으며,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하여, 열변성, 재회합 및 DNA
합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한, 연결 DNA 단편의 제조
방법.
청구항 2
청구항 1에 있어서,
상기 한쪽 회합 가능한 영역을 「영역(1)」이라고 하고, 다른쪽의 회합 가능한 영역을 「영역(2)」라고 하면,
상기 연결 DNA 단편은, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영역-영
역(1)로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 3
청구항 1에 있어서,
연결용 DNA 영역이 2개의 연결용 DNA 영역으로서 배열(A) 및 배열(B)를 포함하며,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지
며, 다른쪽이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 가지며, 배열 T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열
에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 VP1 및 VT1를 가지며, 다른
쪽이 말단측으로부터 배열 VP2 및 VT2를 가지고, 배열 VP1 및 VT1는, 배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열
을 가지며, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방
법.
청구항 4
공개특허 10-2013-0029460
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청구항 3에 있어서,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시되며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1로 표시되고,
상기 연결 DNA 단편은, VT2－VP2(T2－P2)－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자-VT2－VP2(T2－
P2)－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)를 적어도 1개 갖는 DNA 단편으로서, 단, VT2－VP2(T2－P2)는, T2－
P2와 상동적인 VT2－VP2인 것을 의미하며, VP1－VT1(P1－T1)는, T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는
것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 5
청구항 3 또는 4에 있어서,
배열 P2의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열
(B)의 VP2와 인접하는 배열과 비상동적인 배열이며, 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대
해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열(A)의 VP1와 인접하면 비상동적인 배열인 것을 특징으로 하는
제조 방법.
청구항 6
청구항 1 내지 4 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 7
청구항 1 내지 6 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여,
연결 DNA 단편에 포함되는 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 증폭하
도록,
연결 DNA 단편에 포함되는 다른 연결용 DNA 영역에서 기능하는 포워드 프라이머(Forward primer) 및 리버스 프
라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR를 실시하고,
적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 포함한 DNA 단편을 제조하는
방법.
청구항 8
청구항 3에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여,
배열(A)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자를 향하도록 3＇말단에 포함된 포워드 프라이머 및,
배열(B)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자를 향하도록 3＇말단에 포함된 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실
시하고, 배열(A), 표적 유전자의 배열 및 배열(B)가 연결된 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 DNA 단편을 제조하는
방법.
청구항 9
표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨 연결 DNA 단편을
제조하는 방법에 있어서,
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지며, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1) 및 연결
용 DNA 영역(2)를 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)를 준비하고,
공개특허 10-2013-0029460
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(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
(1)의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2
중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단
편(2)의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이
연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1) 및 (2)를 이용하여, 열변성, 재
회합 및 DNA 합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한, 연결 DNA 단편
의 제조 방법.
청구항 10
청구항 9에 있어서,
연결용 DNA 영역(1)이 배열(A)를 포함하며, 연결용 DNA 영역(2)가 배열(B)를 포함하며,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지
며, 다른쪽이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 갖고, 배열 T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에
포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT1 및 VP1를 가져지며 연결용
2중 가닥 DNA 단편 (2)의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT2 및 VP2를 가지며, 배열 VP1 및 VT1는,
배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 가지며, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기
배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 11
청구항 10에 있어서,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시되며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)은, 배열(A)－VP1－VT1로 표시되며, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)는,
VT2－VP2－배열(B)로 표시되며,
상기 연결 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자-VT2－VP2(T2－P2)－배열(B)를 적어도 1개갖는
DNA 단편으로서, 단, VT2－VP2(T2－P2)는, T2－P2와 상동적인 VT2－VP2인 것을 의미하고, VP1－VT1(P1－T1)는,
T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 12
청구항 10 또는 11에 있어서,
배열 P2의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열(B)의
VP2와 인접하는 배열과 비상동적인 배열이며, 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 가
닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열(A)의 VP1와 인접하는 배열과 비상동적인 배열인 것을 특징으로 하
는 제조 방법.
청구항 13
청구항 9 내지 13 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레이오티드를 포함한 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
공개특허 10-2013-0029460
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청구항 14
청구항 9 내지 13 중 어느 한 항에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여,
연결 DNA 단편에 포함되는 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 증폭하
도록,
연결 DNA 단편에 포함되는 다른 연결용 DNA 영역에서 기능하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여
PCR를 실시하고, 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 포함한 DNA 단편
을 제조하는 방법.
청구항 15
청구항 10에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로서,
배열(A)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자로 향하도록 3＇말단에 포함된 포워드 프라이머 및 배열(B)의 염기
배열의 일부를 표적 유전자로 향하도록 3＇말단에 포함된 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하고, 배열
(A), 표적 유전자의 배열 및 배열(B)가 연결된 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 DNA 단편을 제조하는 방법.
청구항 16
표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결 DNA 단편을 제조하는 방법에 있어서,
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회합
가능한 영역을 가지며, 또한, 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염
기 배열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 연결용 DNA 영역을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 준비하고,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중
가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하여, 열변성, 재회합 및 DNA
합성 반응을 1회 실시하여 이형 2중 가닥 DNA 산물을 얻고, 이어서,
상기 이형 2중 가닥 DNA 산물을 주형으로 하여 폴리머라제 연쇄 반응을 실시함으로써, 상기 편측 연결 DNA 단편
을 얻는 것을 포함한, 편측 연결 DNA 단편의 제조 방법.
청구항 17
청구항 16에 있어서,
연결용 DNA 영역이 배열(A)를 포함하며,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지며, 배열
T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT1 및 VP1를 가지며, 배열 VP1 및
VT1는, 배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 가지며,
상기 이형 2중 가닥 DNA 산물을 주형으로 하는 폴리머라제 연쇄 반응은, 상기 이형 2중 가닥 DNA 산물의 표적
유전자의 일부를 상기 표적 유전자의 돌출 말단 측에 향하도록 3＇말단에 포함한 프라이머 및 상기 이형 2중 가
닥 DNA 산물의 배열(A)의 일부를 상기 표적 유전자 측에 향하도록 3＇말단에 포함한 프라이머를 이용하는 것을
특징으로 하는 제조 방법.
청구항 18
공개특허 10-2013-0029460
- 5 -
청구항 17에 있어서,
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자로 표시되며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1로 표시되고,
상기 편측 연결 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자를 적어도 1개 갖는 DNA 단편이다, 단,
VP1－VT1(P1－T1)는, T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 19
청구항 17 또는 18에 있어서,
배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열
(A)의 VP1와 인접하는 비상동적인 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 20
청구항 16 내지 18 중 어느 한 항에 있어서,
상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 21
청구항 3, 4, 10 또는 11에 있어서,
표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레오티드에, 데옥시뉴클레오티드 터미날 트
랜스 퍼라제(teminal trans ferase)를 작용시켜서, 표적 유전자의 배열을 포함한 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자
단편을 얻는 것을 다시 포함하는(단, 상기 표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편은, 배열 P1 및 배열
P2를 각 말단에 가지며, 상기 배열 P1의 안쪽의 일부에 배열 T1를 가지고, 상기 배열 P2의 안쪽의 일부에 배열
T2를 가지며, 또한, 상기 배열 T1 및 T2의 한쪽 또는 양쪽 모두는, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가짐) 것
을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 22
청구항 17 또는 18에 있어서,
표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레오티드에, 데옥시뉴클레오티드 터미널 트
랜스 퍼라제를 작용시키고, 표적 유전자의 배열을 포함한 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 얻는 것을 다시
포함하는(단, 상기 표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편은, 배열 P1를 한쪽 말단에 가지며, 상기 배
열 P1의 안쪽 일부에 배열 T1를 가지며, 또한, 상기 배열 T1는, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가짐) 것을
특징으로 하는 제조 방법.
청구항 23
청구항 3, 4, 10 또는 11에 있어서,
상기 배열 T1 및 배열 T2의 한쪽 또는 양쪽 모두가, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하
는 제조 방법.
청구항 24
청구항 3, 4, 10 또는 11에 있어서,
상기 배열 P1 및 배열 P2의 한쪽 또는 양쪽 모두가, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하
는 제조 방법.
청구항 25
청구항 3, 4, 10, 11, 17 또는 18에 있어서,
상기 배열 P1 및 P2는 독립적으로 10 염기 이상인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
공개특허 10-2013-0029460
- 6 -
청구항 26
청구항 1 내지 25 중 어느 한 항에 있어서,
상기 표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자이며, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 상
기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 배열을 포함하고, 그리고 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
또는 상기 배열(A)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 상기 영역 VP1 및 영역 VT1은, 항체 유전자 또
는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
청구항 27
청구항 26에 있어서,
상기 표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자이며, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 상
기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 배열을 포함하며, 그리고,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 상기 배열(B)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 상기 영역 VP2
및 영역 VT2는, 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열인 것을 특징으로
하는 제조 방법.
청구항 28
청구항 26 또는 27에 기재된 방법으로 제조된 연결 DNA 단편을 이용하여 항체 또는 T세포 수용체를 제조하는
방법.
청구항 29
표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단 측
에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을 가지며,
또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열
이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편.
청구항 30
중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하고, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편.
청구항 31
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하며, 양말단
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지며, 또한 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열이
며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중 가
닥 유전자 단편과,
(2) 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단
편,
과의 조합체이며, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법
에 이용되는 조합체.
청구항 32
청구항 31에 있어서,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의
한쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연
결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반
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응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열
이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 조합체.
청구항 33
연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편 (1) 또는 연결
용 DNA 영역(2)를 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2).
청구항 34
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하며, 양말단
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지고, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편과,
(2) 연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편 (1) 또는
연결용 DNA 영역(2)를 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)
와의 조합체이며, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨
연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 조합체.
청구항 35
청구항 34에 있어서,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한편의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
(1)의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2
중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반
응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편
(2)의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연
결용 2중 가닥 DNA 단편(2)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성
반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는 것을 트징으로 하는 조합체.
청구항 36
표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회합 가능
한 영역을 가지며, 또한 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배
열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중 가닥
유전자 단편.
청구항 37
연결용 DNA 영역을 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편.
청구항 38
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에서, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회합 가능
한 영역을 가지며, 또한 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배
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열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중 가닥
유전자 단편과,
(2) 연결용 DNA 영역을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체이
며,
표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 조
합체.
청구항 39
청구항 38에 있어서,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의
회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중 가닥
DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반
응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 조합체.
청구항 40
청구항 30 내지 35, 청구항 37 내지 39 중 어느 한 항에 있어서,
상기 연결용 DNA 영역은, 인트론(intron), 엑손(exon), 형광 단백질 유전자, His 태그 등의 각종 태그
배열이나, 균이나 동물 세포 내에서 여러 가지의 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터, 인핸서(enhancer)
배열, 폴리 A 부가배열 등으로 이루어지는 군에서부터 선택되는 적어도 1종의 배열인 것을 특징으로 하는 연결
용 2중 가닥 DNA 단편 또는 조합체.
청구항 41
청구항 29에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 청구항 30에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는
청구항 31 또는 청구항 32에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결
시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
청구항 42
청구항 29에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 청구항 33에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는
청구항 34 또는 청구항 35에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽
측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
청구항 43
청구항 36에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 청구항 37에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는
청구항 38 또는 청구항 39에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨
편측 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
청구항 44
청구항 41 내지 43 중 어느 한 항에 있어서,
상기 연결용 DNA 영역은, 인트론, 엑손, 형광 단백질 유전자, His 태그 등의 각종 태그 배열이나, 균이나 동물
세포 내에서 여러 가지의 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터, 인핸서 배열, 폴리 A 부가배열 등으로 이
루어지는 군에서부터 선택되는 적어도 1종의 배열인 것을 특징으로 하는 키트.
명 세 서
기 술 분 야
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본 출원은, 2009년 9월 4일 출원된 일본 특원 2009－205308호를 우선권을 주장하고, 이들 모든 기재는, 여기에[0001]
특히 개시로서 원용된다.
배 경 기 술
DNA 클로닝이란, 일반적으로, 표적 유전자 단편을 플라즈미드(Plasmid), 파지(Pharge), 코스미드(cosmid) 등의[0002]
자기 복제능을 갖는 벡터에 결합하여 대장균 등의 숙주에 도입하여 증식시킴으로써, 동일 유전자 집단을 만들어
내는 기술을 말한다. 대장균에 있어서의 클로닝 및 서브 클로닝은, 중합 효소(polymerase) 연쇄 반응(PCR) 방법
등에 의해 증폭된 표적 유전자 단편을, DNA 리가제(ligase)를 이용하여 복제 개시점과 항생제의 선택 표식을 갖
는 벡터에 결합하여 대장균 세포 안에 도입한 후, 항생제 내성을 조사하는 것으로 클로닝된 균체를 선별하는 방
법으로 실시된다.
기존의 DNA 클로닝법에 대해서는, 삽입 DNA와 벡터를 동일 인식 부위의 제한 효소로 절단하는 것이나, 제한 효[0003]
소를 선택하는 경우에도 삽입 DNA나 벡터의 내부를 절단하지 않는 것을 선택하는 것, 등이 요구된다는 제한이
있다.
최근, 특정 염기 배열을 인식하여 DNA 단편간의 재조합을 재촉하는 배열 특이적인 유전자 재조합 효소를 이용한[0004]
부위 특이적 재조합 기술이나 상동 재조합 기술이 표적 유전자 단편의 클로닝에 이용되어 제한 효소 등의 처리
를 실시하지 않고, 대량의 유전자가 재빠른 클로닝 및 단백질의 발현을 위해서 범용되기 시작하고 있다.
그러나, 상동 재조합 기술을 이용한 경우라도, 대장균 등의 미생물을 이용한 플라즈미드의 증폭 및 정제 공정은[0005]
필요하고, 작업은 여전히 번잡하며, 경제성도 나쁘다.
대장균 등의 미생물을 이용한 핵외 유전자의 증폭 및 정제 공정을 실시하지 않고, 표적 유전자 단편을 표적 유[0006]
전자 이외의 특정의 기능을 갖는 1개 또는 복수의 DNA 단편과, 상기 기능이 발현할 수 있는 상태에서 연결시켜
서, 동일 염기 배열을 갖는 유전자 집단을 제조하는 방법으로서 연결 PCR법이 알려져 있다(특허 문헌 1, 및 비
특허 문헌 1 및 2를 참조). 여기에서는, 「표적 유전자 이외의 특정의 기능을 갖는 DNA 단편」이란, 프로모터
배열 및 폴리 A 부가배열이다.
특허 문헌 1에 기재된 방법에서는, 프로모터 배열, 표적 유전자 배열 및 폴리 A 부가배열을 독립적으로 포함한[0007]
3종의 DNA 단편을 RNA-DNA 키메라프라이머를 이용하여 PCR 증폭한다. 이어서, 증폭된 DNA 단편을 RNase에 의해
처리하는 것으로 RNA 프라이머 부위를 제거하고, 각 DNA 단편 말단에 생긴 3＇돌출 영역의 서로의 상보성을 이
용하여, DNA 리가제를 이용하여 3종의 DNA 단편을 결합시키고 있다. 이것을 주형으로 한 PCR를 실시하는
것으로, 프로모터 배열, 표적 유전자 배열 및 폴리 A 부가배열을 이 순서에 기능적으로 연결시킨 연결 DNA 단편
을 대량으로 제조할 수 있다(특허 문헌 1의 도 1을 참조).
비특허 문헌 1 및 2에서는, 유전자 증폭에 이용하는 프라이머의 5＇말단 측에 연결되는 상대방의 DNA 단편의 말[0008]
단 영역과 상동적인 배열을 부가한 프라이머를 이용하여 프로모터 배열, 표적 유전자 배열 및 폴리 A 부가배열
을 각각 독립하여 증폭하고 있다. 이들 3종의 DNA 단편을 이용하고, 연결 PCR를 실시하는 것으로, 프로모터 배
열, 표적 유전자 배열 및 폴리 A 부가배열이 기능적으로 연결된 연결 DNA 단편을 제조하는 방법이 기재되어 있
다(비특허 문헌 1의 도 2 및 비특허 문헌 2의 도 1을 참조).
선행기술문헌
특허문헌
(특허문헌 0001) WO 03/091440 A [0009]
비특허문헌
(비특허문헌 0001) Nikolai A.Shevchuk et al., Nucleic Acids Research, 2004, Vol. 32, No. 2 e19 [0010]
(비특허문헌 0002) H.-X.Liao et al., Journal of Virological Methods, 158, (2009), pp.171-179 ; 특허 문
헌 1 및 비특허 문헌 1~2의 모든 기재는, 여기에 특히 개시로서 원용된다.
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발명의 내용
해결하려는 과제
표적 유전자 단편은 일반적으로 PCR 산물로서 조제되지만, PCR시의 프라이머의 주형으로의 결합의 특이성이 낮[0011]
은 경우나 주형에 프라이머 배열과 유사한 배열이 복수 존재하는 경우 등에서는, 비특이적 증폭 반응이 생기는
결과, 양단의 프라이머 배열에 끼워진 영역이, 클로닝의 대상인 표적 유전자가 아닌 비특이적 증폭 생성 DNA 단
편이 생길 수 있다.
종래의 연결 PCR법에서는, 각 DNA 단편을 증폭하기 위해서 사용되는 프라이머 중에, 연결에 이용하기 위한 배열[0012]
이 부가되고 있다. 본 프라이머를 이용하여 증폭된 개개의 DNA 단편에는, 다른 DNA 단편과 하이브리다이즈
(hybridize)하기 위한 배열이 DNA 단편 말단 측에 도입된다. 이어서, 증폭된 DNA 단편을 혼합하여 연결 PCR를
실시하는 것으로, 2종류 이상의 DNA 단편이 결합한 「연결 DNA 단편」이 형성된다.
그러나 상기의 방법에서는, 유전자 증폭 반응에 의해 얻어지는 PCR 산물의 프라이머 배열에 끼워진 영역이 표적[0013]
유전자에 유래하는 배열이 아닌 단편에 대해서도, 표적 유전자 단편과 동일하게 「연결 DNA 단편」이 형성된다.
또 만일 유전자 증폭 반응에 의해 표적 유전자 단편만이 증폭된 경우라도, 반응액 중에는 유전자 증폭에 이용된[0014]
프라이머가 잔존하고 있어, 이것을 제거하지 않고 연결 PCR 반응을 실시하면, 「연결 DNA 단편」의 구성요소인
각 DNA 단편의 증폭이 「연결 DNA 단편」의 증폭에 우선하여 생기기 위해, 목적으로 하는 표적 유전자에 유래하
는 배열을 포함한 「연결 DNA 단편」의 형성은 곤란하다.
따라서, 상기 특허 문헌 및 비특허 문헌에 기재된 방법에서는, 표적 유전자 단편의 PCR 증폭 후, PCR 증폭 산물[0015]
은, 프라이머 및 비표적 유전자 배열을 포함한 DNA 단편의 혼입의 영향을 무시할 수 있는 정도로 정제되지 않으
면 안된다.
이상과 같이, 2개 이상의 2중 가닥 DNA 단편을 결합시킨 「연결 DNA 단편」을 종전의 방법으로 제조하려면, 표[0016]
적 유전자 이외의 특정의 기능을 갖는 1개 또는 복수의 DNA 단편과 연결하기 전의 공정의 하나로서, 비표적 유
전자 배열을 포함한 DNA 단편 및 표적 유전자 증폭에 이용한 프라이머의 혼재가 연결 반응에 주는 영향을 무시
할 수 있는 정도로, PCR 증폭 산물에 포함되는 표적 유전자 배열을 포함한 DNA 단편을 정제하는 것이 요구된다.
그러나, 표적 유전자 단편의 길이가 비표적 유전자 단편의 길이와 유사한 경우에는 표적 유전자 단편의 분리가
곤란하다. 이 때문에, 이러한 경우에는, 목적으로 하는 표적 유전자에 유래하는 배열을 포함한 「연결 DNA 단편
」만을 얻는 것이 불가능해진다.
따라서, 본 발명의 목적은, 표적 유전자 배열을 포함한 PCR 증폭 산물에 하나 이상의 2중 가닥 DNA 단편을 결합[0017]
시키고, 목적으로 하는 표적 유전자에 유래하는 배열을 포함한 「연결 DNA 단편」을 제작하는 방법이며, 상기
PCR 증폭 산물을 정제하지 않고, 상기 「연결 DNA 단편」을 특이적으로 제작할 수 있는 방법을 제공하는 것에
있다.
과제의 해결 수단
본 발명자들은, 예의 연구를 반복한 결과, [0018]
표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편과,[0019]
이 2중 가닥 유전자 단편과 연결하기 위한 연결용 DNA 영역을 포함한 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 연결하는데[0020]
있어,
(1) 상기 2중 가닥 유전자 단편으로서 중앙부에 표적 유전자를 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을[0021]
가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을 가지며, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의
영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자에 포함되는 고유의 배열이며, 양쪽 모두 회합 가능한 영역의 3
＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 상기 2중 가닥 DNA 단편으로서 중앙부에 연결용 DNA 영역을 적어도 1개를 포함하며, 양말단 측에 각각 회합[0022]
가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 준비하고,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의[0023]
한쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연
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결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 상기 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합[0024]
성 반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0025]
의 다른쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배
열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 상기 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA[0026]
합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하고, 열변성, 재회합 및 DNA[0027]
합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 2중 가닥 유전자 단편에, 비표적 유전자를 포함한 유전자 단편
이나, 상기 2중 가닥 유전자 단편을 PCR로 증폭하기 위하여 이용한 프라이머가 공존하고 있는 경우라도,
비표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역이 연결한 연결 DNA 단편의 비특이적인 생성은 억제하며, 표[0028]
적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨, 목적으로 하는 연결 DNA 단편을 특이적으로 얻는
것에 성공하여, 본 발명의 제1 형태(청구항 1에 기재된 발명)을 완성하였다.
여기서 한쪽 회합 가능한 영역을 「영역(1)」, 다른쪽 회합 가능한 영역을 「영역(2)」라고 하면, 3＇말단 돌출[0029]
2중 가닥 유전자 단편은, 모식적으로 영역(1)-표적 유전자-영역(2)로 표시되는 배열을 가지며, 연결용 2중 가닥
DNA 단편은, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 가지며, 연결 DNA 단편은, 모식적
으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 적어
도 1개 갖는 것이다.
또한 연결용 DNA 영역이 2개의 연결용 DNA 영역(1) 및 (2)를 포함한, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역(2)-[0030]
연결용 DNA 영역(1)-영역(1)로 표시되는 배열을 갖는 경우에는, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역(2)-연결용
DNA 영역(1)-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영역(2)-연결용 DNA 영역(1)-영역(1)로 표시되는 배열을
적어도 1개 갖는 것이 된다.
또한, 본 발명자들은, 상기 본 발명의 제1 형태에 있어서의 연결용 2중 가닥 DNA 단편을, 모식적으로 영역(1)-[0031]
연결용 DNA 영역(1) 및 연결용 DNA 영역(2)-영역(2)로 각각 표시되는 배열을 갖는 2개의 연결용 2중 가닥 DNA
단편(1) 및 2로 나누는 것에서도, 비표적 유전자의 한쪽의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA
영역(2)가 연결된 연결 DNA 단편의 비특이적인 생성을 억제하여, 표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역(1),
다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨, 목적으로 하는 연결 DNA 단편을 특이적으로 얻는 것에 성공하여,
본 발명의 제2 형태(청구항 9에 기재된 발명)을 완성하였다.
여기서 얻어지는 연결 DNA 단편은, 모식적으로 연결용 DNA 영역(1)-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영[0032]
역(2)로 표시되는 배열을 갖는 것이다.
또한, 본 발명자들은, 상기 본 발명의 제2 형태에 있어서의, 2개로 나눈 어느 한쪽 연결용 2중 가닥 DNA 단편,[0033]
모식적으로 영역(1)-연결용 DNA 영역(1) 또는 연결용 DNA 영역(2)-영역(2)로 표시되는 배열을 이용하는 것으로,
비표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역(1) 또는 (2)를 연결시킨 연결 DNA 단편의 비특이적인 생성을 억제
하고, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1) 또는 (2)를 연결시킨, 목적으로 하는 편측 연결 DNA 단편
을 특이적으로 얻는 것에 성공하여, 본 발명의 제3 형태(청구항 16에 기재된 발명)을 완성하였다.
또한, 본 발명은, 상기 본 발명의 제1 형태 ~ 제3 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 연결[0034]
용 2중 가닥 DNA 단편 및 이들 조합체, 또 이들을 포함한 키트를 포함한다.
본 발명은 이하와 같다.[0035]
[1] 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법에 있어서,[0036]
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에서부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단[0037]
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지고, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편을 준비하고,
공개특허 10-2013-0029460
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(2) 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단[0038]
편을 준비하고,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0039]
의 한쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열
이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반[0040]
응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단[0041]
편의 다른쪽의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의
배열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0042]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하여, 열변성, 재회합 및 DNA[0043]
합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한, 연결 DNA 단편의 제조
방법.
[2] [1]에 있어서, 상기 한쪽 회합 가능한 영역을 「영역(1)」이라고 하고, 다른쪽의 회합 가능한 영역을 「영[0044]
역(2)」라고 하면, 상기 연결 DNA 단편은, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-
연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[3] [1]에 있어서, 연결용 DNA 영역이 2개의 연결용 DNA 영역으로서 배열(A) 및 배열(B)를 포함하며, [0045]
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지[0046]
며, 다른쪽이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 가지며, 배열 T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열
에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 VP1 및 VT1를 가지며, 다른[0047]
쪽이 말단측으로부터 배열 VP2 및 VT2를 가지고, 배열 VP1 및 VT1는, 배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열
을 가지며, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방
법.
[4] [3]에 있어서, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시되며,[0048]
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1로 표시되고, [0049]
상기 연결 DNA 단편은, VT2－VP2(T2－P2)－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자-VT2－VP2(T2－[0050]
P2)－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)를 적어도 1개 갖는 DNA 단편으로서, 단, VT2－VP2(T2－P2)는, T2－
P2와 상동적인 VT2－VP2인 것을 의미하며, VP1－VT1(P1－T1)는, T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는
것을 특징으로 하는 제조 방법.
[5] [3] 또는 [4]에 있어서, 배열 P2의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖[0051]
지 않는 배열은 상기 배열(B)의 VP2와 인접하는 배열과 비상동적인 배열이며, 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출
말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열(A)의 VP1와 인접하면 비상동적인
배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[6] [1]~[4] 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열인 것을[0052]
특징으로 하는 제조 방법.
[7] [1]~[6]의 어느 하나에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여, [0053]
연결 DNA 단편에 포함되는 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 증폭하[0054]
도록,
연결 DNA 단편에 포함되는 다른 연결용 DNA 영역에서 기능하는 포워드 프라이머(Forward primer) 및 리버스 프[0055]
라이머(Reverse primer)를 이용하여 PCR를 실시하고,
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적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 포함한 DNA 단편을 제조하는[0056]
방법.
[8] [3]에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여,[0057]
배열(A)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자를 향하도록 3＇말단에 포함된 포워드 프라이머 및 [0058]
배열(B)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자를 향하도록 3＇말단에 포함된 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실[0059]
시하고, 배열(A), 표적 유전자의 배열 및 배열(B)가 연결된 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 DNA 단편을 제조하는
방법.
[9] 표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨 연결 DNA 단편[0060]
을 제조하는 방법에 있어서,
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양말단[0061]
측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지며, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1) 및 연결[0062]
용 DNA 영역(2)를 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)를 준비하고,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0063]
(1)의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2
중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0064]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단[0065]
편(2)의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이
연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0066]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1) 및 (2)를 이용하여, 열변성, 재[0067]
회합 및 DNA 합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한, 연결 DNA 단편
의 제조 방법.
[10] [9]에 있어서, 연결용 DNA 영역(1)이 배열(A)를 포함하며, 연결용 DNA 영역(2)가 배열(B)를 포함하며, [0068]
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 한쪽이 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지[0069]
며, 다른쪽이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 갖고, 배열 T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에
포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT1 및 VP1를 가져지며 연결용[0070]
2중 가닥 DNA 단편 (2)의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT2 및 VP2를 가지며, 배열 VP1 및 VT1는,
배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 가지며, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기
배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[11] [10]에 있어서, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시되며, [0071]
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)은, 배열(A)－VP1－VT1로 표시되며, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)는,[0072]
VT2－VP2－배열(B)로 표시되며,
상기 연결 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자-VT2－VP2(T2－P2)－배열(B)를 적어도 1개 갖는[0073]
DNA 단편으로서, 단, VT2－VP2(T2－P2)는, T2－P2와 상동적인 VT2－VP2인 것을 의미하고, VP1－VT1(P1－T1)는,
T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
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[12] [10] 또는 [11]에 있어서, 배열 P2의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에서 가닥 신장 기능을 갖[0074]
지 않는 배열은 상기 배열(B)의 VP2와 인접하는 배열과 비상동적인 배열이며, 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출
말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 배열은 상기 배열(A)의 VP1와 인접하는 배열과 비상
동적인 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[13] [9]~[11] 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레이오티드를 포함한 배열인[0075]
것을 특징으로 하는 제조 방법.
[14] [9]~[13] 중 어느 하나에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여[0076]
연결 DNA 단편에 포함되는 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 증폭하[0077]
도록,
연결 DNA 단편에 포함되는 다른 연결용 DNA 영역에서 기능하는 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머를 이용하여[0078]
PCR를 실시하고, 적어도 1개의 적어도 일부의 연결용 DNA 영역과 표적 유전자의 배열의 모두를 포함한 DNA 단편
을 제조하는 방법.
[15] [10]에 기재된 방법으로 제조한 연결 DNA 단편을 주형으로 하여,[0079]
배열(A)의 염기 배열의 일부를 표적 유전자로 향하도록 3＇말단에 포함된 포워드 프라이머 및 배열(B)의 염기[0080]
배열의 일부를 표적 유전자로 향하도록 3＇말단에 포함된 리버스 프라이머를 이용하여 PCR를 실시하고, 배열
(A), 표적 유전자의 배열 및 배열(B)가 연결된 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 DNA 단편을 제조하는 방법.
[16] 표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결 DNA 단편을 제조하는 방법에 있어서,[0081]
(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회합[0082]
가능한 영역을 가지며, 또한, 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염
기 배열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편을 준비하고,
(2) 연결용 DNA 영역을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 준비하고, [0083]
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0084]
의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중
가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0085]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하여, 열변성, 재회합 및 DNA[0086]
합성 반응을 1회 실시하여 이형 2중 가닥 DNA 산물을 얻고,
이어서, 이 이형 2중 가닥 DNA 산물을 주형으로서 폴리머라제 연쇄 반응을 실시함으로써, 상기 편측 연결 DNA[0087]
단편을 얻는 것을 포함한, 편측 연결 DNA 단편의 제조 방법.
[17] [16]에 있어서, 연결용 DNA 영역이 배열(A)를 포함하며, [0088]
상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가지며, 배열[0089]
T1 및 배열 T2의 적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며,
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 말단측으로부터 배열 VT1 및 VP1를 가지며, 배열 VP1 및[0090]
VT1는, 배열 P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 가지며,
상기 이형 2중 가닥 DNA 산물을 주형으로 하는 폴리머라제 연쇄 반응은, 상기 이형 2중 가닥 DNA 산물의 표적[0091]
유전자의 일부를 상기 표적 유전자의 돌출 말단 측에 향하도록 3＇말단에 포함한 프라이머 및 상기 이형 2중 가
닥 DNA 산물의 배열(A)의 일부를 상기 표적 유전자 측에 향하도록 3＇말단에 포함한 프라이머를 이용하는 것을
특징으로 하는 제조 방법.
[18] [17]에 있어서, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자로 표시되며, [0092]
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1로 표시되고, [0093]
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상기 편측 연결 DNA 단편은, 배열(A)－VP1－VT1(P1－T1)－표적 유전자를 적어도 1개 갖는 DNA 단편으로서, 단,[0094]
VP1－VT1(P1－T1)는, T1－P1와 상동적인 VT1－VP1인 것을 의미하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[19] [17] 또는 [18]에 있어서, 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을[0095]
갖지 않는 배열은 상기 배열(A)의 VP1와 인접하는 비상동적인 배열인 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[20] [16]~[18] 중 어느 하나에 있어서, 상기 돌출 말단은, 3＇말단에 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열인[0096]
것을 특징으로 하는 제조 방법.
[21] 3], [4], [10] 또는 [11]에 있어서, 표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레[0097]
오티드에, 데옥시뉴클레오티드 터미날 트랜스 퍼라제(teminal trans ferase)를 작용시켜서, 표적 유전자의 배열
을 포함한 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 얻는 것을 다시 포함하는(단, 상기 표적 유전자의 배열을 포함
한 2중 가닥 DNA 단편은, 배열 P1 및 배열 P2를 각 말단에 가지며, 상기 배열 P1의 안쪽의 일부에 배열 T1를 가
지고, 상기 배열 P2의 안쪽의 일부에 배열 T2를 가지며, 또한, 상기 배열 T1 및 T2의 한쪽 또는 양쪽 모두는,
표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가짐) 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[22] [17] 또는 [18]에 있어서, 표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레오티드에,[0098]
데옥시뉴클레오티드 터미널 트랜스 퍼라제를 작용시키고, 표적 유전자의 배열을 포함한 3＇말단 돌출 2중 가닥
유전자 단편을 얻는 것을 다시 포함하는(단, 상기 표적 유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편은, 배열 P1
를 한쪽 말단에 가지며, 상기 배열 P1의 안쪽 일부에 배열 T1를 가지며, 또한, 상기 배열 T1는, 표적 유전자에
고유의 염기 배열을 가짐) 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[23] [3], [4], [10] 또는 [11]에 있어서, 상기 배열 T1 및 배열 T2의 한쪽 또는 양쪽 모두가, 표적 유전자에[0099]
고유의 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[24] [3], [4], [10] 또는 [11]에 있어서, 상기 배열 P1 및 배열 P2의 한쪽 또는 양쪽 모두가, 표적 유전자에[0100]
고유의 염기 배열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
[25] 3], [4], [10], 11], [17] 또는 [18]에 있어서, 상기 배열 P1 및 P2는 독립적으로 10 염기 이상인 것을[0101]
특징으로 하는 제조 방법.
[26] [1]~[25] 중 어느 하나에 있어서, 상기 표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자이며, 상기 3[0102]
＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 상기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 배열을 포함하고,
그리고 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 상기 배열(A)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 상기
영역 VP1 및 영역 VT1항, 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열을 갖는
것을 특징으로 하는 제조 방법.
[27] [26]에 있어서, 상기 표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자이며, 상기 3＇말단 돌출 2중[0103]
가닥 유전자 단편이 상기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 배열을 포함하며, 그리고
상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 상기 배열(B)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 상기 영역 VP2[0104]
및 영역 VT2는, 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열인 것을 특징으로
하는 제조 방법.
［28］［26］ 또는［27］에 기재된 방법으로 제조된 연결 DNA 단편을 이용하여 항체 또는 T세포 수용체를 제조[0105]
하는 방법.
［29］ 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양[0106]
말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지며, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편.
［30］ 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하고, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA[0107]
단편.
［31］ (1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하며,[0108]
양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며,상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지며, 또한 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열이
공개특허 10-2013-0029460
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며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중 가
닥 유전자 단편과,
(2) 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단[0109]
편
과의 조합체이며, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법[0110]
에 이용되는 조합체.
［32］ (3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA[0111]
단편의 한쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배
열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반[0112]
응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0113]
의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열
이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0114]
반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는［31］에 기재된 조합체.
［33］연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편 (1) 또는[0115]
연결용 DNA 영역(2)를 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2).
［34］(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하며,[0116]
양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 가지며, 상기 회합 가능한 2개의 영역은 서로 회합하지 않는 염기 배열을
가지고, 또한 한쪽 또는 양쪽 모두의 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 양쪽 모두의 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단
돌출 2중 가닥 유전자 단편과,
(2) 연결용 DNA 영역(1)을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편 (1) 또는[0117]
연결용 DNA 영역(2)를 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)
와의 조합체이며, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨[0118]
연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 조합체.
［35］ [34]에 있어서, (3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한편의 회합 가능한 영역은, 상기 연[0119]
결용 2중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말
단측의 배열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반[0120]
응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0121]
(2)의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연
결용 2중 가닥 DNA 단편(2)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0122]
반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 조합체.
［36］표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회[0123]
합 가능한 영역을 가지며, 또한 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편.
［37］ 연결용 DNA 영역을 포함하고, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편.[0124]
［38］(1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에서, 상기 표적 유전자 배열의 한쪽 말단 측에 회[0125]
합 가능한 영역을 가지며, 또한 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
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염기 배열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편과,
(2)연결용 DNA 영역을 포함하며, 말단 측에 회합 가능한 영역을 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의[0126]
조합체이며,
표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 조[0127]
합체.
［39］[38]에 있어서, (3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용[0128]
2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배
열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반[0129]
응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는,［38］에 기재된 조합체.
［40］［30］~［35］,［37］~［39］의 어느 하나에 있어서, 상기 연결용 DNA 영역은, 인트론(intron), 엑손[0130]
(exon), 형광 단백질 유전자, His 태그 등의 각종 태그 배열이나, 균이나 동물 세포 내에서 여러 가지의 유전자
의 발현을 제어할 수 있는 프로모터, 인핸서(enhancer) 배열, 폴리 A 부가배열 등으로 이루어지는 군에서부터
선택되는 적어도 1종의 배열인 것을 특징으로 하는 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 조합체.
［41］［29］에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편,［30］에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는［[0131]
31］또는 32에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA
단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
［42］［29］에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편,［33］에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는［[0132]
34］또는［35］에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결
용 DNA 영역(2)를 연결시킨 연결 DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
［43］［36］에 기재된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편,［37］에 기재된 연결용 2중 가닥 DNA 단편, 또는［[0133]
38］또는［39］에 기재된 조합체를 포함한, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결
DNA 단편을 제조하는 방법으로 이용되는 키트.
［44］ ［41］~［43］의 어느 하나에 기재된 상기 연결용 DNA 영역은, 인트론, 엑손, 형광 단백질 유전자, His[0134]
태그 등의 각종 태그 배열이나, 균이나 동물 세포 내에서 여러 가지의 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모
터, 인핸서 배열, 폴리 A 부가배열 등으로 이루어지는 군에서부터 선택되는 적어도 1종의 배열인 것을 특징으로
하는 키트.
발명의 효과
본 발명의 방법에 의하면, 비특이적인 증폭으로 얻을 수 있던 유전자 증폭 산물 공존하에서, 표적 유전자 증폭[0135]
산물을 특이적으로 연결용 DNA 단편에 연결시킬 수 있다. 본 발명의 방법에 따르면, 표적 유전자에 대해서, 표
적 유전자 배열을 포함한 DNA 단편의 정제의 유무와 관계없이, 예를 들면, 연결용 DNA 단편에 포함되어 있던 배
열(A) 및 배열(B)를, 배열(A)－표적 유전자 배열-배열(B)가 이 순서로 기능적으로 연결한 연결 DNA 단편을 특이
적으로 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 따르면, 배열(A)를 프로모터 배열, 배열(B)를 폴리 A 부가배열로 하는 것으로, 배열(A)－표적[0136]
유전자 배열-배열(B)가 이 순서로 기능적으로 연결한 연결 DNA 단편을 숙주 세포에 도입하면, 표적 유전자 배열
을 발현시킬 수 있다. 후에 상술하지만, 상기 배열을 이 순서로 기능적으로 연결시킨 배열을 갖는 2중 가닥 DNA
의 단위가, 상기와 같이 프로모터 배열 및 폴리 A 부가배열을 기능적으로 연결시킨 배열과 같이, 이 표적 유전
자 배열의 발현에 필요한 최소 구성의 2중 가닥 DNA 단편으로 이루어지는 경우, 이것을 본 발명에서는 발현 유
니트라고 칭할 수 있다.
상기 발현 유니트는, 대장균을 이용하여 조제된 환상형 벡터와 달리, 시험관 내에서 합성된 선상 2중 가닥 DNA[0137]
단편이기 때문에, 엔도톡신(endotoxin) 등의 균체에 유래하는 유해 물질의 혼입이 없다. 그 결과, 표적 유전자
가 코드하는 단백질을 유해 물질의 영향이 없는 상태로 숙주 세포를 이용하여 특이적이고 대량으로 생산시키는
것이 가능해진다.
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도면의 간단한 설명
도 1은 본 발명의 제1 형태를 설명하기 위한 반응 스킴(scheme)이다.[0138]
도 2는 본 발명의 제1 형태의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 반응 스킴이다.
도 3은 본 발명의 제1 형태의 하나의 실시형태에서, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응에 대해 핵산 신장 산물이
생기지 않고, 연결 DNA 단편을 얻을 수 없는 경우를 설명하기 위한 반응 스킴이다.
도 4는, 본 발명의 제1 형태의 하나의 실시형태에 의해서 얻어지는 연결 DNA 단편으로부터, 원하는 2중 가닥
DNA 단편을 얻기 위한 방법을 설명하기 위한 반응 스킴이다.
도 5는, 본 발명의 제1 형태의 하나의 실시형태에 의해서 얻어지는 연결 DNA 단편으로부터, 원하는 2중 가닥
DNA 단편을 얻기 위한 방법으로, 원하는 2중 가닥 DNA 단편을 얻을 수 없는 경우를 설명하기 위한 반응 스킴이
다.
도 6은 본 발명의 제2 형태의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 반응 스킴이다.
도 7은 본 발명의 제3 형태의 하나의 실시형태를 설명하기 위한 반응 스킴이다.
도 8은 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편과, 표적 및 비표적 유전자 단편의 혼합물을 상기 선택적
연결 방법에 제공하여 얻은 증폭 산물을 아가 로스 겔 전기 영동으로 확인한 도면이다.
레인 1：3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 표적 유전자 단편(1)을 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편
에 연결시키는 것으로 얻어진, 프로모터-인간 γ가닥 유전자-폴리 A 부가배열로 이루어지는 연결 단위(인간 γ
가닥 유전자 발현 유니트),
레인 2:3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가비표적 유전자 단편(2)를 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편
에 연결하는 것으로 얻어진 연결 단위：
레인 3： 표적 유전자 단편(1)을 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 연결하는 것으로 얻어지는 인
간 γ가닥 유전자 발현 유니트,
레인 4： 비표적 유전자 단편(2)를 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 연결하는 것으로 얻어지는
연결 단위
도 9는, 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 표적 유전자 단편(1)과 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편
의 결합에 의해 생긴 인간 γ가닥 유전자 발현 유니트의 집합체를 미스매치 프라이머 또는 통상의 프라이머를
이용하여 PCR에 제공하고, 증폭된 DNA를 아가 로스 겔 전기 영동으로 확인한 도면이다.
레인 1 및 2 프라이머 E 및 F를 이용한 인간 γ가닥 유전자 발현 유니트의 증폭,
레인 3 및 4 프라이머 G 및 H를 이용한 인간 γ가닥 유전자 발현 유니트의 증폭
도 10은 표적 유전자 단편(1)의 염기 배열의 설명도이다.
도 11은 비표적 유전자 단편(2)의 염기 배열의 설명도이다.
도 12는 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 염기 배열의 설명도이다.
도 13은 자기 비즈를 이용한 cDNA 합성법(면역 글로블린 가변 영역 증폭법)의 설명도이다.
도 14는 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 제조 방법의 모식도이다.
도 15는 예 3에서, 인간 플라스마 세포 1 및 2로 γ가닥 및 κ가닥 가변 영역을 증폭한 결과를 나타낸
도면이다.
도 16은 인간κ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 염기 배열의 설명도이다.
도 17은 예 3에서, 증폭된 γ가닥 및 κ가닥 가변 영역을 발현 유니트로 변환한 결과를 나타낸 도이다.
도 18은 예 3에서, ELAISA법을 이용하여 세포 배양액중에 분비된 재편성 인간 면역 글로블린을 측정한 결과를
나타낸 도이다.
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발명을 실시하기 위한 구체적인 내용
[용어의 정의］ [0139]
본 명세서에서, 이하의 용어는 이하에 표시되는 의미를 갖는 것으로 한다.[0140]
「표적 유전자 배열」은, 본 발명의 방법에서, 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 연결시킨 연결 DNA 단편을 특이적으[0141]
로 얻고 싶은 유전자의 배열이다. 표적 유전자 배열의 예는 후술한다.
「2중 가닥 유전자 단편」은, 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥의 유전자 단편이다. [0142]
「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」은, 2중 가닥 유전자 단편의 양쪽 모두의 3＇말단에 돌출 말단을 갖는[0143]
유전자 단편이다.
「연결용 2중 가닥 DNA 단편」은, 본 발명의 방법에서, 연결 DNA 단편을 얻기 위해서 표적 유전자 배열에 연결[0144]
시키는 DNA 단편이다.
「회합 가능한 영역」은, 후술하는 「열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응」에 있어서의 재회합(어닐링)에서, 연결[0145]
용 2중 가닥 DNA 단편이 갖는 2개의 「회합 가능한 영역」의 한쪽과 회합할 수 있는 영역이다.
「표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열」은, 표적 유전자 배열에 포함되는, 표적 유전자가 본래 갖는[0146]
염기 배열이다.
「연결 DNA 단편」은, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 2중 가닥 연결 DNA 단편이[0147]
다.
「편측 연결 DNA 단편」은, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 2중 가닥 연결 DNA 단편이[0148]
다.
「연결 단위」란, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)를 의미한다.[0149]
「연결 단위 집합체」는, 복수의 연결 단위가 늘어선 DNA 단편을 의미한다.[0150]
「전사 가닥(sense strand)」은, 2중 가닥 DNA의 임의의 한쪽의 외가닥 DNA가닥을 의미하고, 「안티센스 가닥」[0151]
이란, 임의의 한쪽의 외가닥 DNA가닥이 「전사 가닥」인 경우의 2중 가닥 DNA의 다른쪽의 외가닥 DNA가닥을 의
미한다.
「영역」은, 해당하는 개소의 전사 가닥의 배열과 안티센스 가닥의 배열로 이루어지는 부분을 의미한다.[0152]
상기 이외의 용어에 대해서도, 이하의 명세서 중에서 정의하고 있는 용어는, 그 정의의 의미로 이용된다.[0153]
［본 발명의 제1 형태］ [0154]
본 발명의 제1 형태에 대해, 이하에 상세하게 설명한다.[0155]
본 발명의 제1 형태는, 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」및 「연결용 2중 가닥 DNA 단편」으로부터, 표적[0156]
유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 「연결 DNA 단편」을 제조하는 방법이다.(도 1 참조)
「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」[0157]
본 발명의 제1 형태에서는, (1) 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에서부터, 「3＇말단 돌출 2중[0158]
가닥 유전자 단편」을 준비한다. 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」은, 도 1의 최상단에 나타낸 바와
같이, 중앙부에 표적 유전자 배열을 포함하고, 양쪽 모두 말단 측에 회합 가능한 영역(회합 가능한 영역(1) 및
회합 가능한 영역(2))을 각각 갖는다.
본 발명에 있어서의 「표적 유전자 배열」은, 특별히 제한되지 않는다. 「표적 유전자 배열」은, 예를 들면,[0159]
항체 유전자의 배열일 수 있고, 항체 유전자의 배열의 한편의 말단에 위치하는 배열은, 항체 유전자의 정상 영
역 유래의 배열일 수 있다. 「표적 유전자 배열」은, 항체 유전자의 배열 이외에, T세포 수용체 유전자, 스플라
이싱 베어리언트(splicing variant) 등의, 프라이머 영역 및 그것에 인접하는 안쪽 배열이 일정하지만, 내부에
가변 부위를 갖는 DNA 배열일 수도 있다.
「회합 가능한 영역」은, 후술하는 「열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응」에 있어서의 재회합(어닐링)에서, 연결[0160]
용 2중 가닥 DNA 단편이 갖는 2개의 「회합 가능한 영역」의 한쪽과 회합할 수 있는 영역이다. 3＇말단 돌출 2
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중 가닥 유전자 단편의 「회합 가능한 영역」과 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 「회합 가능한 영역」의 회합 관계
는 후술한다.
「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」의 양말단의 회합 가능한 2개의 영역은, 서로 회합하지 않는 염기 배열[0161]
을 가진다.「서로 회합하지 않는 염기 배열」은, 한쪽의 「회합 가능한 영역」의 전사 가닥 및 안티센스 가닥
모두가, 다른쪽의 「회합 가능한 영역」의 전사 가닥 및 안티센스 가닥 모두 회합하지 않는 염기 배열을 의미한
다.
또한, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 「회합 가능한 영역」의 한쪽 또는 양쪽 모두는, 적어도 일부의 염[0162]
기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열이다.「표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배
열」은, 표적 유전자 배열에 포함되는, 표적 유전자가 본래 갖는 염기 배열이다.「회합 가능한 영역」이 포함한
표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열은, 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편으로부터
「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」이 준비될 때에, 표적 유전자 배열을 포함한 2중 가닥 유전자 단편에 포
함되어 있던 염기 배열을 그대로 보존하여 남겨진 배열이다. 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」에는, 「회
합 가능한 영역」의 상기 염기 배열 이외에, 표적 유전자 배열도 보존되어 남아 있는 것은 말할 필요도 없다.
환언하면, 「회합 가능한 영역」의 상기 염기 배열은, 표적 유전자 배열의 일부이다고도 말할 수 있다. 본 발명
의 제1 형태의 방법으로 제조한 「연결 DNA 단편」으로부터, 새로운 추가의 공정(새로운 추가의 공정에 대해서
는 후술함)을 거쳐, 최종적으로 목적으로 하는 표적 유전자 배열로부터 이 표적 유전자 배열이 코드하는 단백질
을 발현시키는 경우, 상기 「회합 가능한 영역」에 포함되는 「표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열
」이 코드하는 부분도, 발현하는 단백질의 일부가 되는 경우가 있다.
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, 양쪽 모두 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출[0163]
말단을 가진다. 이 돌출 말단은, 뉴클레오티드의 외가닥로 이루어지며 각각, 한쪽 말단은, 「회합 가능한 영역
」의 3＇말단에 결합하여, 다른쪽의 말단, 즉, 3＇말단은 미결합의 개방 상태이다.
상기 돌출 말단은, 연결용 2중 가닥 DNA 단편이 갖는 회합 가능한 영역과의 사이에서, 이하의 것 (3-2) 및 (3-[0164]
4)의 관계를 갖는다.
(3-2) 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반응에서[0165]
가닥 신장 기능을 갖지 않는다.
(3-4) 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한편의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반응에[0166]
서 가닥 신장 기능을 갖지 않는다.
본 발명에서, 「DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는」배열과는, 상대측의 외가닥과 하이브리다이[0167]
즈하지 않으며, 그 결과, 상대측의 외가닥을 주형으로서 DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장이 생기지 않는 것을
의미한다. 예를 들면, 서로 DNA끼리인 경우에, 상대측의 외가닥과 적어도 하나의 뉴클레오티드가 상보적이지 않
은 배열은, 「DNA 합성 반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않는」배열이다. 단, 하이브리다이즈의 조건은, 1 사이
클째 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응에 있어서의 재회합의 조건이다. 1 사이클째의 재회합의 조건은, 후술한
다. 또는, 3＇말단이 DNA 합성 반응에 대해 다음의 뉴클레오티드를 부가할 수 없는 구조를 갖는 뉴클레오티드,
예를 들면, 디데옥시뉴클레오티드인 배열은, 「DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는」배열이다.
돌출 말단과 연결용 2중 가닥 DNA 단편이 갖는 회합 가능한 영역이, 상기 (3-2) 및 (3-4)의 관계를 갖는[0168]
것으로, PCR로 조제된 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에, 표적 유전자에 상당하는 영역에 비표적 유전자를
포함한 비표적 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이나, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 원이 되는
2중 가닥 유전자 단편을 PCR로 증폭하기 위해서 이용한 프라이머가 공존하고 있는 경우라도, 2 사이클
실시되는, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응에서, 비표적 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 주형으로 한,
비표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역이 연결한 비표적 연결 DNA 단편의 생성을 억제할 수 있다.
그 결과, 비표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역이 연결한 비표적 연결 DNA 단편의 비특이적인 생
성을 억제할 수 있다. 보다 구체적인 설명은 후술한다.
「연결용 2중 가닥 DNA 단편」[0169]
(2) 본 발명에서는, 중앙부에 연결용 DNA 영역을 포함하며, 양말단 측에 각각 회합 가능한 영역을 갖는 연결용[0170]
2중 가닥 DNA 단편을 준비한다. 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 도 1 위에서부터 2번째에 나타낸 바와 같이, 연결
용 DNA 영역의 양쪽 모두의 말단 측에 회합 가능한 영역(회합 가능한 영역 (1) 및 회합 가능한 영역(2))을 각각
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갖는다.
연결용 DNA 영역은, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결하고, 연결 DNA 단편에 추가의 기능을 부여할 수 있는[0171]
DNA 영역이라면 특별히 제한은 없다. 연결용 DNA 영역은, 예를 들면, 인트론, 엑손, 형광 단백질 유전자, His
태그 등의 각종 태그 배열이나, 균이나 동물 세포 내에서 여러 가지의 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모
터, 인핸서 배열, 폴리 A 부가배열 등을 들 수 있다.
상술한 바와 같이, 한쪽 회합 가능한 영역을 「영역(1)」, 다른쪽의 회합 가능한 영역을 「영역(2)」라고 하면,[0172]
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, 모식적으로 영역(1)-표적 유전자-영역(2)로 표시되는 배열을 가지며, 연
결용 2중 가닥 DNA 단편은, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 가지며, 연결 DNA
단편은, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되
는 배열을 적어도 1개 갖는 것이다. 따라서, 예를 들면, 연결용 DNA 영역이 형광 단백질 유전자인 경우에는, 연
결 DNA 단편은, 영역(2)-형광 단백질 유전자-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-형광 단백질 유전자-영역(1)로 표시
되는 배열을 적어도 1개 갖는 것이 된다.
또, 표적 유전자를 숙주 세포로 발현시켜서, 표적 유전자가 코드하는 단백질을 조제하고 싶은 경우에는, 연결용[0173]
DNA 영역으로서 폴리 A 부가배열과 프로모터의 2개의 연결용 DNA 영역(1) 및 (2)를 포함한 연결용 2중 가닥 DNA
단편을 이용한다. 이 경우, 연결용 2중 가닥 DNA 단편은 모식적으로 영역(2)-폴리 A 부가배열-프로모터-영역
(1)로 표시되는 배열을 가진다. 이 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용하면, 연결 DNA 단편은, 모식적으로 영역
(2)-폴리 A 부가배열-프로모터-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-폴리 A 부가배열-프로모터-영역(1)로 표시되는 배
열을 적어도 1개 갖는 것이 된다.
이어서, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역과 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영[0174]
역과의 관계에 대해 설명한다.
우선, 본 명세서에서, 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 「회합 가능한 영역」은,[0175]
후술하는 「열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응」에 있어서의 재회합에서, 재회합에 앞서는 열변성에서, 외가닥에
해리시킨 DNA(유전자) 단편이, 상보적인 염기 배열을 갖는 외가닥의 유전자(DNA) 단편과 하이브리다이즈하여 2
중 가닥을 형성할 수 있는 영역을 의미한다. 단, 회합 가능한지 아닌지는, 서로 상보적인 염기 배열을 갖는 2
개의 외가닥 DNA(유전자) 단편의 길이나 염기 배열에도 따르지만, 재회합의 조건은, 외가닥이 된 회합 가능한
영역의 길이가 11 뉴클레오티드 이상으로, 재회합시의 어닐링 온도가 계산된 Tm값보다 0℃에서 20℃로 낮은 온
도인 경우에, 회합할 수 있는 것을 의미하는 것으로 한다.
본 발명의 제1 형태에 대해서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역과 연결용 2중 가닥[0176]
DNA 단편의 회합 가능한 영역은, 이하의 것 (3-1) 및 (3-3)의 관계를 갖는다.
(3-1) 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역(도 1중의 회합 가능 영역(1))은, 연결용[0177]
2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 말단의 회합 가능한 영역(도 1중의 회합 가능 영역(1v)과 상동적인 염기 배열로 이루
어지지만, 3＇돌출 말단과 결합하는 말단측이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA
영역과 결합하는 측이다. 즉, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역(회합 가능 영역
(1))과 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 말단의 회합 가능한 영역(회합 가능 영역(1)v)이란, 상동적인 염기 배
열로부터 된다. 그러나, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역의 말단측이, 연결용 2중
가닥 DNA 단편의 한쪽의 말단의 회합 가능한 영역에서는, 연결용 DNA 영역과 결합하는 측(안쪽)에 위치한다.
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역(도 1중의 회합 가능 영역(2))은, 상[0178]
기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역(도 1중의 회합 가능 영역(2v)과 상동적인 염기
배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능한 영역
에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이다. 상기 (3-1)와 동일하게, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다
른쪽 회합 가능한 영역(회합 가능 영역(2))과 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역(회
합 가능 영역(2v)은, 상동적인 염기 배열로 이루어진다. 그러나, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽
회합 가능한 영역의 말단측이, 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역에서는, 연결용 DNA
영역과 결합하는 측에 위치한다.
본 발명의 제1 형태에서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 회합 가능한 영역과 연결용 2중 가닥 DNA 단[0179]
편의 회합 가능한 영역이, 상기 (3-1) 및 (3-3)의 관계를 갖는 것으로, 2 사이클째 실시되는, 열변성, 재회합
및 DNA 합성 반응에 의해서, 표적 유전자가, 양측을 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)에 끼워진, 모식적으로 영
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역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 적어도 1개
갖는 연결 DNA 단편을 얻을 수 있다. 보다 구체적인 설명은 후술하는 구체적인 예에 대해 실시한다.
「열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응」[0180]
본 발명의 제1 형태에서는, (4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 이용[0181]
하여, 열변성 재회합 및 DNA 합성 반응을 적어도 2회 실시하는 것으로, 상기 연결 DNA 단편을 얻는 것을 포함한
다. 도 1에는, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응을 2회 실시하는 예를 표시된다. 열변성, 재회합 및 DNA 합성
반응의 상세한 조건에 대해서는, 후술한다. 이 방법으로 제조되는 연결 DNA 단편은, 도 1의 최하단에 나타낸 바
와 같이, 상기 한쪽의 회합 가능한 영역(회합 가능 영역(1))을 「영역(1)」이라고 하고, 다른쪽 회합 가능한 영
역(회합 가능 영역(2))을 「영역(2)」라고 하면, 모식적으로 영역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)-표적 유전자-영
역(2)-연결용 DNA 영역-영역(1)로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편이 된다.
「 제1 형태의 실시형태」본 발명의 제1 형태의 하나의 실시형태를, 도 2를 참조하여, 다시 상세하게 설명한다. [0182]
도 2에 표시되는 실시형태에서는,[0183]
(i) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능 영역(1)은, 말단측으로부터 배열 P1 및 T1를 가[0184]
지고, 다른쪽의 회합 가능 영역(2)이 말단측으로부터 배열 P2 및 T2를 가진다. 그리고, 배열 T1 및 배열 T2의
적어도 한쪽은 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열을 가지며, 바람직하게는 배열 T1 및 배열 T2의
양쪽 모두가 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의 염기 배열을 가진다. 또한, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단
편은, 한쪽 가닥의 배열 P2의 3＇말단에 돌출 말단으로서 1 뉴클레오티드 이상의 배열 NNNNN를 가지며, 또한,
다른쪽 가닥의 상기 배열 P1의 3＇말단에 돌출 말단으로서 1 뉴클레오티드 이상의 배열 NNNNN를 가진다. 또한,
NNNNN는, 1 뉴클레오티드 이상의 배열을 의미하는 것이며, 뉴클레오티드가 5인 것을 의미하는 것은 아니다.
(ii) 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 연결용 DNA 영역이 연결용 DNA 영역으로서 배열(A) 및 배열(B)를 포함하[0185]
며,
(iii) 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능 영역(1v)은, 말단측으로부터 배열 VT1 및 VP1를[0186]
가지며, 다른쪽 회합 가능 영역(2v)은 말단측으로부터 배열 VT2 및 VP2를을 가지며, 배열 VP1 및 VT1는, 배열
P1 및 T1와 각각 상동적인 염기 배열을 갖고, 배열 VP2 및 VT2는, 배열 P2 및 T2와 각각 상동적인 염기 배열을
가진다.
또한, 상기 구체적 형태에서는,[0187]
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시된다(단, 여기에서는, 3＇말단 돌출[0188]
말단은 표시되어 있지 않다. 3＇말단 돌출 말단을 NNNNN라고 표기하면, NNNNN－P1－T1－표적 유전자-T2－P2－
NNNNN와 표시될 수 있다). 또, 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1로
표시된다. 또한, 연결 DNA 단편은, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1－표적 유전자-VT2－VP2－배열(B)－배
열(A)－VP1－VT1로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편이다. 단, VT2－VP2와 T2－P2란, 상동적인 배열이
며, VP1－VT1와 P1－T1는, 상동적인 배열인 것부터, 연결 DNA 단편은, T2－P2－배열(B)－배열(A)－P1－T1－표적
유전자-T2－P2－배열(B)－배열(A)－P1－T1로 표시되는 배열을 적어도 1개 갖는 DNA 단편이다, 라고도 말할 수
있다.
＜실시형태에 있어서의 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편＞ [0189]
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 대해 다시 상세하게 설명한다. 배열 P1 및 P2는, 프라임되어야 할 프라이[0190]
머에 특이적으로 하이브리다이즈 되는 배열 및 길이라면 특별히 제한은 없고, 길이에 대해서는, 예를 들어, 10
염기 이상이며, 바람직하게는 10~100 염기이며, 보다 바람직하게는 15~50 염기이며, 더욱 바람직하게는 15~30
염기이다. 영역 P1 및 P2의 한쪽 또는 양쪽 모두는, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가져도 된다. 또, 영역
P1 및 P2의 한쪽 또는 양쪽 모두의 모든 배열이, 표적 유전자의 배열의 일부의 배열이어도 된다. 또한, 후술하
는 바와 같이, 영역 P1 및 P2는, 각각, 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 영역 VP1 및 VP2와 상동적인 염기 배열로
이루어진다.
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편은, 배열 P1의 안쪽에 배열 T1를 가지며, 배열 P2의 안쪽에 배열 T2를 가진[0191]
다. 이들 배열 T1 및 T2의 한쪽 또는 양쪽 모두는, 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가진다. 배열 P1와 배열
T1와의 사이, 배열 P2와 배열 T2와의 사이, 배열 T2가 표적 유전자에 고유의 배열을 갖는 경우에 있어서의 배열
T1와 표적 유전자의 배열과의 사이, 배열 T1가 표적 유전자에 고유의 배열을 갖는 경우에 있어서의 배열 T2와
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표적 유전자의 배열과의 사이에는, 열변성·재회합·DNA 합성 반응에서, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의
각 가닥과 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 각 가닥과의 2중 가닥 형성을 방해하지 않는 범위에서, 스
페이서-배열 등의 배열을 가져도 된다. 배열 T1 및 T2의 자세한 것은, 후술한다.
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 3＇돌출 말단은, 예를 들면, 배열 P1 및 배열 P2의 각각의 3＇말단에 설[0192]
치된 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 배열과는 다른 적어도 1개 이상의 뉴클레오티드로 이루어지는 배열이다. 이 3
＇돌출 말단은, 상술한 대로, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1와의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에서,
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 각 가닥의 양 3＇말단을 기점으로 한 핵산 신장을 방지하기 위해서 설치
되고 있다. 따라서, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 안티센스 가닥이라고 표시한 가닥의 3＇말단에 설치
된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 가닥 NNNNN는, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1
－VT1의 전사 가닥이라고 표시한 가닥의 배열 VP1의 5＇측(배열(A)측)의 배열과 비상보적인 뉴클레오티드 또는
적어도 일부가 비상보적인 배열의 뉴클레오티드가닥이라면 특별히 제한은 없고, 길이에 대해서는, 예를 들어, 1
염기 이상이며, 바람직하게는 2~100 염기이며, 보다 바람직하게는 5~50 염기이다.
이와 같이, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 전사 가닥이라고 표시한 가닥의 3＇말단에 설치된 뉴클레오티[0193]
드 또는 뉴클레오티드 가닥 NNNNN는, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 안티
센스 가닥의 영역 VP2의 5＇측(배열(B)측)에 연결된 배열과 비상보적인 뉴클레오티드 또는 적어도 일부가 비상
보적인 배열의 뉴클레오티드 가닥이라면 특별히 제한은 없고, 길이에 대해서는, 예를 들어, 1 염기 이상이며,
바람직하게는 2~100 염기이며, 보다 바람직하게는 5~50 염기이다.
또 배열 P1(P2)의 3＇돌출 말단에 설치된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드가닥의 3＇말단의 뉴클레오티드가, 디[0194]
데옥시뉴클레오티드와 같이, 배열 P1(P2)의 3＇말단으로부터의 DNA 신장 반응을 저지할 수 있는 화합물일 수도
있다. 이 경우, 배열 P1의 3＇말단에 설치된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드가닥 NNNNN는, 연결용 2중 가닥
DNA 단편 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 전사 가닥이라고 표시한 가닥의 배열 VP1의
5＇측(배열(A)측)의 배열과 상보적인 뉴클레오티드일 수도 있다. 이와 같이, 배열 P2의 3＇말단에 설치된 뉴클
레오티드 또는 뉴클레오티드가닥 NNNNN는, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의
안티센스 가닥이라고 표시한 가닥의 배열 VP2의 5＇측(배열(A)측)의 배열과 상보적인 뉴클레오티드일 수도
있다.
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 제조 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 표적 유전자를 주형으[0195]
로서 이용하는 PCR에 의해서 제조할 수 있다. 이하에, 면역 글로블린 유전자의 가변 영역과 정상 영역의 일부를
갖는 2중 가닥 DNA 단편을 표적 유전자 단편으로 하는 경우를 예에, 도 13에 근거하여 설명한다. 도 13에 표시
되는 프라이머(2)의 배열(의 일부)이, 3＇돌출 말단을 갖는 표적 2중 가닥 DNA 단편의 배열 T1에 상당하고, 프
라이머(4)와 (3)이 3＇돌출 말단을 갖는 2중 가닥 DNA 단편의 배열 P1와 P2에 상당한다. 또, 프라이머(3)의 상
류 측에 연결하는 정상 영역에 유래하는 배열이, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 배열 T2에 상당한다.
우선, 자기 비즈를 이용하여 표적 유전자를 코드하는 mRNA를 회수하고, 이어서, 리버스 트랜스크립타아제[0196]
(Reverse transcriptase)를 이용한 역전사진 반응에 의해 cDNA를 합성한다. 이어서, 합성한 cDNA의 3＇말단에,
터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스 퍼라제를 이용하여 폴리 dG를 부가시킨다. 이어서, 3＇말단에 폴리 dG를 부
가시킨 면역 글로블린 cDNA(자기 비즈상에 합성된 것)를 주형으로서 프라이머(1; 면역 글로블린 유전자 정상 영
역)으로 (2; 폴리 dG와 회합 해 DNA 합성을 실시하기 위한 것)를 이용하여, 1회째의 PCR를 실시한다.
1회째의 PCR 종료후, 이것을 예를 들면, 100배 정도로 희석한 것을, 2번째의 PCR의 주형으로서 이용한다. 사용[0197]
하는 프라이머는 4와 3이다. 프라이머(4)는, 3＇말단측의 배열이 1회째의 PCR로 사용한 프라이머(2)의 5＇말단
측과 오버랩 하도록 설계되어 있고, 이 영역에 프라이머(4)를 결합시킨다. 프라이머(3)은 정상 영역에
위치하고, 1회째의 PCR로 사용한 프라이머(1)의 안쪽에 위치하도록 설계한 프라이머이다. 다만, 프라이머(3)은,
프라이머(1)과 일부가 오버랩하는 배열을 가지고 있어도 되지만, 프라이머(1)과 오버랩하지 않는 배열을 가질
수도 있다. 1회째의 PCR로 면역 글로블린의 정상 영역을 포함한 DNA 단편이 증폭되고 있으면, 프라이머(3)과
(4)를 이용하는 것으로, 다시 면역 글로블린의 정상 영역을 포함한 DNA 단편, 즉, 면역 글로블린의 정상 영역을
표적 유전자 배열로서 포함한 2중 가닥 DNA 단편을 증폭할 수 있다. RACE(RAPID AMPLIFICATION OF cDNA END)
법으로 불리는 PCR법의 하나이다. 또한, 프라이머 4＋2 배열은, 2회의 PCR로, 프라이머(2)와 (4)에 의해 합성된
인공적인 배열이며, 주형의 배열에 특유(고유)의 배열은 갖지 않는다.
2번째의 PCR에서는, 프라이머 4가 특이적으로, 1회째의 PCR로 증폭된 DNA 단편의 3'말단 영역에 결합하여(프라[0198]
이머 2의 배열을 가지기 위해), 프라이머(3)이 프라이머(1)의 더욱 안쪽의 면역 글로블린 정상 영역에
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결합한다. 그 결과, 특이적인 증폭이 실시된다. 이 경우는 반드시, PCR 산물의 한쪽 편에는 4＋2의 배열이 존재
하게 된다. 그러나 실제로는, 사용한 프라이머가 이것과 유사한 염기 배열을 갖는 비표적 유전자에 결합한
결과, 비특이적인 PCR 산물이 합성되어 버리기도 한다. 예를 들면, 프라이머(4)가 비특이적으로 다른 DNA 단편
에 결합한 경우에는, 합성된 DNA 단편에는 프라이머(4)의 배열이 그 말단에 존재하지만, 그 안쪽에는 프라이머
(2)의 배열, 즉, 배열 T1는 존재하지 않는다.
또, 만약 프라이머(3)이 이것과 유사한 염기 배열을 갖는 비표적 유전자에 결합하여 DNA 증폭을 한 경우, 이[0199]
DNA 단편에는 정상 영역의 배열, 즉 배열 T2가 존재하지 않는다. 프라이머(3)에 의해서 형성되는 배열은, 주형
의 배열에 특유(고유)의 배열이다.
상기 2번째의 PCR에서 얻어지는 PCR 산물, 즉, 표적 유전자(항체 유전자)의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편의[0200]
3＇돌출 말단에 적어도 1개의 뉴클레오티드를 설치하는 방법은 특별히 제한되지 않지만, 예를 들면, 상기 표적
유전자의 배열을 포함한 2중 가닥 DNA 단편 및 폴리데옥시뉴클레오티드에, 데옥시뉴클레오티드 터미널 트랜스를
작용시키고, 3＇돌출 말단을 갖는 2중 가닥 DNA 단편을 얻는 것을 포함한 방법을 들 수 있다. 이 방법에
의해서, 양 3＇말단에 적어도 1개의 뉴클레오티드를 설치하여 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 얻을 수 있
다.
＜실시형태에 있어서의 연결용 2중 가닥 DNA 단편＞ [0201]
「연결용 2중 가닥 DNA 단편」(VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1)은, 임의의 배열(A) 및 배열(B)를[0202]
가지며, 상기 배열(A)의 말단 측에 상기 배열 P1에 상동적인 염기 배열로 이루어지는 영역 VP1를 가지며, 상기
배열(B)의 말단 측에 상기 배열 P2에 상동적인 염기 배열로 이루어지는 영역 VP2를 가지며, 상기 3＇말단 돌출
2중 가닥 유전자 단편에 있어서의 배열 P1의 안쪽의 일부의 배열 T1에 상동적인 염기 배열로 이루어지는 영역
VT1를 상기 영역 VP1의 말단 측에 가지며, 또한, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 있어서의 배열 P2
의 안쪽의 일부의 배열 T2에 상동적인 염기 배열로 이루어지는 영역 VT2를 상기 영역 VP2의 말단 측에 갖는 연
결용 2중 가닥 DNA 단편이다. 단, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 있어서의 배열 T1 및 배열 T2의
적어도 한쪽은 표적 유전자에 고유의 염기 배열을 가지며, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 있어서의
배열 P2의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 배열이 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열 또는 상기 연결용 2중 가닥
DNA 단편의 한쪽 가닥의 배열(B)와 비상동적인 배열이며, 또한, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 있
어서의 배열 P1의 3＇말단에 있는 돌출 말단의 배열이 디데옥시뉴클레오티드를 포함한 배열 또는 상기 연결용 2
중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 가닥의 배열(A)와 비상동적인 배열이다. 또한, 본 명세서에서 말하는 「영역」은,
해당하는 개소의 전사 가닥의 배열과 안티센스 가닥의 배열로 이루어진다.
도 2~3에 표시되는 스킴으로부터 알 수 있듯이, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 배열 T1 및 T2는, 「연결[0203]
용 2중 가닥 DNA 단편」인 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 VT1 및 VT2에 대해서 내부 배열의 역할을
다하고, 표적 유전자의 배열을 포함한 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1
－VT1와의 선택적인 재회합과 거기에 계속하는 DNA 합성 반응의 진행을 촉진한다. 여기서, 「내부 배열」은, 표
적 유전자 배열에 특유의 배열이며, 표적 유전자 배열의 말단에 위치하는 증폭용 프라이머 배열과 상동적인 배
열을 갖는 P1 및 P2의 안쪽의 배열(T1 및 T2)을 가리키며, 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 VT1 및 VT2와 상동적인
배열을 가진다. 따라서 비표적 유전자 단편은 모식적으로, P1－비표적 유전자 단편-P2 또는 P1－T1－비표적 유
전자 단편-P2 또는 P1－비표적 유전자 단편-T2－P2로 표시된다. 「내부 배열의 역할」은, 연결용 2중 가닥 DNA
단편과 표적 2중 가닥 유전자 단편과의 특이적인 재회합과 거기에 계속하는 DNA 합성 반응의 진행을 촉진하며,
또한, 비표적 2중 가닥 유전자 단편과의 재회합과 거기에 계속하는 DNA 합성 반응의 진행을 저해하는 역할을 갖
는 배열이다.
3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 배열 T1와 VT2－VP2－배열(B －배열(A)－VP1－VT1의 영역 VT1, 및, 3＇말[0204]
단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 배열 T2와 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 영역 VT2는, 각각, 서로
상동적인 염기 배열로 이루어지는 것이라면 특별히 제한은 없다. VT1 및 VT2의 길이는, 각각, 예를 들면, 1 염
기 이상이며, 바람직하게는 2~100 염기이며, 보다 바람직하게는 5~50 염기이다. 배열 P1＋T1, 배열 P2＋T2, 영
역 VP1＋VT1 및 영역 VP2＋VT2는, Tm값이 60℃이상인 것이 바람직하고, 약 68℃에서 70℃인 것이 더욱 바람직하
다.
VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 배열(A)는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면 표적 유전자 단편의 상류[0205]
배열이나, 인트론, 엑손, 형광 단백질 유전자, His 태그 등의 각종 태그 배열이나 균이나 동물 세포 내에서 여
러 가지의 유전자의 발현을 제어할 수 있는 프로모터, 인핸서 배열 등을 들 수 있다. VT2－VP2－배열(B)－배열
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(A)－VP1－VT1의 배열(B)는 특별히 제한되지 않고, 예를 들면, 표적 유전자 단편의 하류 배열이나, 인트론, 엑
손, 형광 단백질 유전자, His 태그 등의 각종 태그 배열이나 폴리 A 부가배열 등을 들 수 있다.
배열(A) 및 배열(B)에 프로모터 배열, 폴리 A 부가배열을 각각 이용하는 경우는, 숙주 세포 내에서의 표적 유전[0206]
자의 발현을 방해하지 않는 범위에서, 각 배열동안, 배열(A)의 상류, 배열(B)의 하류에, 스페이서-배열 등의 배
열이 있어도 된다.
유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 배열(A)와 배열(B)와의 사이의 길이는 특별히 제한되지 않는다.[0207]
또, 배열(A)와 영역 VP1와의 사이, 배열(B)와 영역 VP2와의 사이의 길이는 특별히 제한되지 않는다. 영역 VP1와
VT1와의 사이, 영역 VP2와 VT2와의 사이에는, 3＇돌출 말단을 갖는 2중 가닥 DNA 단편과의 어닐링을 방해하지
않는 범위에서 적당한 길이의 스페이서-배열 등의 배열이 있어도 된다.
「연결용 2중 가닥 DNA 단편」인 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 제조 방법은, 특별히 제한되지 않고,[0208]
공지의 방법을 조합하여 제조할 수 있다. 이하에, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 제조 방법의
일례를, 도 14에 근거하여 구체적으로 설명한다.
제한 효소 1(BamHI) 및 제한 효소 2(NotI)에 의해서 인식되는 부위를 갖는 벡터(pCMV－EGFP)를, 제한 효소(1)로[0209]
처리하고, 제한 효소(1) 인식 부위에 기존 배열(폴리 dG/dC) 및 제한 효소 3(EcoRV)에 의해서 인식되는 부위를
이 순서로 포함한 링커(폴리 dG/dC－EcoRV 링커)를 삽입한다. 이어서, 얻어지는 링커 삽입 벡터를, 제한 효소
(2) 및 (3)에서 처리하고, 제한 효소(3) 인식 부위로부터 제한 효소(2) 인식 부위까지의 배열을, 상류에 제한
효소(3) 절단면을 가지며, 또한, 하류에 제한 효소(2) 절단면을 갖는 표적 유전자의 일부의 배열(인간 말초피임
파구 cDNA로부터 PCR에 의해 얻어진 인간 면역 글로블린 정상 영역)로 치환한다. 얻어진 벡터의 제한 효소(3)
부위에 암피실린 내성 유전자 및 복제 개시점을 삽입한다. 이어서, 카나마이신 내성 유전자-복제 개시점을 본
벡터로부터 제외함으로써 인간 면역 글로블린 중쇄유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편이 삽입된 벡터(pMiniCMV-
hIgG)를 잡을 수 있다. 본 벡터를 주형으로서 폴리 dG/dC영역 및 표적 유전자의 일부의 배열(면역 글로블린 정
상 영역)을 포함한 프라이머를 이용하는 PCR를 실시하는 것으로, 인간 면역 글로블린 중쇄유전자 연결용 2중 가
닥 DNA 단편인 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1를 얻을 수 있다.
이 경우, 폴리 dG/dC가 영역 VT1에 상당하고, 또한 인간 면역 글로블린 정상 영역의 일부가 영역 VT2에 상당하[0210]
여, 배열(A)가 CMV 프로모터에 상당하고, 배열(B)가 면역 글로블린 정상 영역의 나머지의 부분과 폴리 A 부가배
열에 상당한다. 또, 멀티 클로닝 사이트(MCS)와 폴리 dG/dC와의 사이의 배열의 적어도 일부가 영역 VP1에 상당
하고, 또한 인간 면역 글로블린 정상 영역의 적어도 일부의 배열이 영역 VP2에 상당하게 된다.
(1) 열변성·재회합·DNA 합성 반응(1)[0211]
1 사이클째 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 대해 설명한다. 도 2에서는, 열변성·재회합·DNA 합성(1)이라고[0212]
표시한다.
P1－T1－표적 유전자-T2－P2로 표시되는 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」 및 VT2－VP2－배열(B)－배열[0213]
(A)－VP1－VT1로 표시되는 「연결용 2중 가닥 DNA 단편」을 포함한 시료를, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응에
제공하면, 우선, 열변성 후의 재회합(어닐링)에 의해 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」의 한쪽의 가닥(안
티센스 가닥)의 영역 P1＋T1와 「연결용 2중 가닥 DNA 단편」의 한쪽의 가닥(전사 가닥)의 영역 VP1＋VT1와의
사이에서 안정된 2중 가닥 형성이 일어난다. 동일하게, 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」의 전사 가닥의
영역 P2＋T2와 「연결용 2중 가닥 DNA 단편」의 안티센스 가닥의 영역 VP2＋VT2와의 사이에 안정된 2중 가닥 형
성이 일어난다. 이와 같이 하여 얻어지는 2 종류의 2중 가닥은, 이어서, DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성 반응
에 제공된다. 이 DNA 합성 반응(핵산 신장 반응)에 의해서, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 전사 가닥
의 영역 VT1를 기점으로서 핵산이 신장하여 핵산 신장물(2)이 합성되고 또, VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－
VT1의 안티센스 가닥의 영역 VT2를 기점으로서 핵산이 신장하여 핵산 신장물(1)이 합성된다.
VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에 고유의 배열인 내부 배열 T1[0214]
및/또는 T2와 상동적인 염기 배열로 이루어지는 영역 VT1 및/또는 VT2를 가짐으로서, 3＇돌출 말단을 갖는 DNA
단편과의 선택적인 재회합과 그것에 계속하는 DNA 합성 반응을 진행시킬 수 있다. 단, 3＇말단 돌출 2중 가닥
유전자 단편을 준비하는 경우에, 도 13에 표시되는 프라이머(4)가 비특이적으로 비표적 유전자의 배열을 포함한
DNA 단편에 결합한 결과적으로 배열 P1의 안쪽에 배열 T1가 존재하지 않는 2중 가닥 DNA 단편이 생기고, 또,
프라이머(3)이 이것과 유사한 염기 배열을 갖는 비표적 유전자에 결합한 결과적으로 배열 P2의 안쪽에 배열 T2
가 존재하지 않는 2중 가닥 DNA 단편이 생긴다. VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1와 배열 P1의 안쪽에 배
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열 T1가 존재하지 않고 배열 P2의 안쪽에 배열 T2가 존재하지 않는 2중 가닥 DNA 단편을 열변성-재회합 한 후의
DNA 합성 반응에 제공한 경우, 도 3에 표시되는 대로 반응이 진행하지 않아 연결 산물을 얻을 수 없다.
또한, 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」에는 영역 P1 및 P2의 양 3＇말단에, NNNNN로 표기되는 3＇말단[0215]
돌출 말단이 있고, 또한 이 돌출 말단(외가닥 뉴클레오티드)은, DNA 합성 반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지
않는다. 즉, 도 2의 좌측의 핵산 신장물(1)을 주는 스킴에서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 전사 가
닥의 T2－P2에 계속되는 NNNNN는, 회합한 상대측의 가닥(연결용 2중 가닥 DNA 단편의 안티센스 가닥)의 VT2－
VP2에 계속되는 배열(B)의 VP2에 인접하는 배열 또는 VP2와 배열(B)의 사이의 VP2에 인접하는 배열과는 하이브
리다이즈하지 않는다. 이와 같이, T2－P2에 계속되는 NNNNN는, VT2－VP2에 계속되는 배열(B)의 VP2에 인접하는
배열과 하이브리다이즈하지 않기 때문에, 영역 P1 및 P2를 기점으로 한 핵산 신장은 볼 수 없다. 도 2의 우측의
핵산 신장물(2)을 주는 스킴에서도 동일하게 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 안티센스 가닥의 T1－P1에
계속되는 NNNNN는, 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 전사 가닥의 VT1－VP1에 계속되는 배열(A)의 VP1에 인접하는 배
열 또는 VP1와 배열(A)의 사이의 VP1에 인접하는 배열과 하이브리다이즈하지 않기 때문에, 영역 P1 및 P2를 기
점으로 한 핵산 신장은 볼 수 없다.
1 사이클째의 열변성의 조건은, 통상의 PCR에서 채용하고 있는 조건과 동일하여도 좋고, 예를 들면, 열변성을[0216]
90~98℃에서 20~60초일 수 있다. 1 사이클째의 재회합의 조건은, 통상의 PCR에서 채용되고 있는 조건과 동일하
여 좋고, 예를 들면, 60~72℃에서 30초~6분일 수 있다. 1 사이클째의 DNA 합성 반응은, 통상의 PCR에서 채용되
고 있는 조건과 동일하여 좋고, 예를 들면, 68~72℃에서 30초~6분일 수 있다. 사용하는 DNA 폴리머라제의 효소
활성의 지적온도에 따라서는, 어닐링과 핵산 신장을 동일 온도로 실시하여, 하나의 공정으로서 실시해도 된다.
1 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 의해서, 핵산 신장물(1) 및 (2)을 함유하는 반응 생성물을 얻을[0217]
수 있다. 이 반응 생성물에는, 도 2에는 나타내지 않지만, 도 3에서 나타낸, 비표적 유전자를 포함한 단편이 포
함될 가능성이 있다.
(2) 열변성·재회합·DNA 합성 반응(2)[0218]
2 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 대해 설명한다. 도 2에서는, 열변성·재회합·DNA 합성(2)이라[0219]
고 표시한다.
1 사이클째의 반응 생성물을 열변성하고, 이어서 재회합(어닐링)함으로써, 상기 핵산 신장물(1) 및 (2)의 한쪽[0220]
가닥은, 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」의 3＇말단 돌출 배열인 NNNNN는 갖지 않고, 또한,「3＇말단 돌
출 2중 가닥 유전자 단편」의 NNNNN 이외의 배열이 상동적이기때문에, 이 부분에서 2중 가닥이 형성된다. 이어
서, 이 2중 가닥에 대해 DNA 합성 반응에 의해서, 서로의 가닥을 주형으로 하고, 양가닥의 3＇말단으로부터 핵
산이 신장하여, 표적 유전자의 양단의 각각 연결용 2중 가닥 DNA 단편이 연결한 연결 DNA 단편(VT2－VP2－배열
(B)－배열(A)－표적 유전자-배열(B)－배열(A)－V P1－VT1)을 얻을 수 있다. 또한, 3＇말단 돌출 배열인 NNNNN를
갖는 핵산 신장물 (1) 및 (2)로부터의 외가닥 DNA 단편은, 3＇말단에 NNNNN를 가지기 위해서, 재회합(어닐링)에
대해 2중 가닥을 형성하지 못하고, 결과적으로, 이 외가닥 DNA 단편을 주형으로 하는 핵산 신장물은 생기지 않
는다.
2 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 의해서, 상기 연결 DNA 단편(VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－표적[0221]
유전자-배열(B)－배열(A)－V P1－VT1)을 얻을 수 있지만, 이 반응 생성물에는, 도시하고 있지 않지만, 1 사이클
째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응으로 생긴 비특이적인 DNA 단편에 더하여, 핵산 신장물(1) 및 (2)의 주형으
로서 사용되지 않았던 3＇말단 돌출 배열인 NNNNN를 갖는 외가닥 DNA 단편이 포함되게(잔존하게) 된다.
또한, 후술하지만, 상기 연결 DNA 단편(VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－표적 유전자-배열(B)－배열(A)－V P1－[0222]
VT1)에 있어서의, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)가 연결 단위이다.
(3) 열변성·재회합·DNA 합성 반응(3)[0223]
도 2에는 도시하지 않지만, 본 발명의 제1 형태에 대해서는, 2 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 이[0224]
어, 3 사이클째 이후의 열변성·재회합·DNA 합성 반응을 실시할 수도 있다.
3 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에서는, 2 사이클째의 핵산 합성 산물인 VT2－VP2－배열(B)－배열[0225]
(A)－표적 유전자-배열(B)－배열(A)－VP1－VT1의 열변성에 의해 생긴 외가닥 중 어느 2개가, 상동적인 영역에서
하이브리다이즈하고, 이 하이브리다이즈 한 2중 가닥을 주형으로서 DNA 합성 반응에 의한 핵산 신장이 생기면,
2 사이클째의 핵산 합성 산물중의 「배열(A)－표적 유전자-배열(B)」로 이루어지는 연결 단위를 2개 포함한 2중
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가닥 DNA 단편이 얻어진다.
사이클 이후에서는 이 조작이 반복해지는 것으로, 상기 연결 단위를 3개 이상 포함한 연결 단위의[0226]
집합체(이하, 연결 단위 집합체라고 부르기도 함)가 얻어진다. 따라서 3 사이클째 이후의 연결 반응에서 연결용
2중 가닥 DNA 단편 또는 표적 유전자 단편 또는 양자가 고갈한 경우라도, DNA 합성용의 기질이 반응액중에 존재
하여, DNA 폴리머라제의 활성이 유지되는 한, 연결 단위의 증폭을 한다. 즉, 3 사이클째 이후에서는, 표적 유전
자와 연결용 DNA 단편이 잔존하는 경우에는 1 사이클째와 2 사이클째에 상당하는 반응이 일어남과 동시에, 중합
반응도 동시에 진행한다. 그러나 표적 유전자와 연결용 DNA 단편이 잔존하지 않는 경우는, 중합 산물끼리의 반
복 유니트가 어긋나면서 재회합하는 것으로 연결 단위의 증폭을 한다. 그 결과, 후술하는, 표적 유전자 단편,
배열(A)－VP1－VT1 및 VT2－VP2－배열(B)를 이용한, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)가 이 순서로 결합한 연결 단
위의 제조 방법에 비해, 보다 효율이 좋은 연결단위의 제조가 가능해진다.
또한, 열변성·재회합·DNA 합성 반응계에, 「3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」 및 연결용 2중 가닥 DNA 단[0227]
편(VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1) 외에, 후술하는 연결 단위 집합체로부터 연결 단위를 특이적으로 증
폭하기 위한 미스매치 프라이머를 포함해 둘 수도 있다. 이 경우에는, 이러한 미스매치 프라이머가, 열변성에
의해서 외가닥이 된 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 각 외가닥에 프라임하지 않도록, 재회합(어닐링)은 고온하(예
를 들면, 65~72℃)에서 실시하는 것이 바람직하다. 또한, 반응계에 미스매치 프라이머를 포함하며, 어닐링과 핵
산 신장을 동일 온도로 실시할 수도 있고, 이 경우의 열변성·재회합·DNA 합성 반응은, 예를 들면, 열변성을
90~98℃에서 20~60초, 재회합 및 DNA 합성 반응을 65~72℃에서 30초~6분에 실시할 수 있으며, 이 사이클을 2~10
사이클로 할 수 있다. 바람직하게는 열변성을 93~95℃에서 30~50초, 재회합 및 DNA 합성 반응을 68~70℃에서
1~5분에 실시할 수 있으며, 이 사이클을 4~8 사이클이다. 여기서의 사이클은, 1 사이클째의 열변성·재회합·
DNA 합성 반응의 사이클수를 의미한다.
이들 반응에 의해 얻어진 연결 DNA 단편은, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)로이루어지는 연결 단위가, 열변성·[0228]
재회합·DNA 합성 반응의 사이클수에 따라, 상기 연결 단위의 복수개를 직쇄상에 연결하여 포함한 집합체이다.
상기 집합체는, 상기 연결 단위 외에, 배열(A)－VP1－VT1나 VT2－VP2－배열(B)를 말단에 포함한다.
「연결 단위의 조제 공정」[0229]
본 발명의 제1 형태에 대해 핵산 합성 산물로서 얻어진 연결 DNA 단편은, 열변성·재회합·DNA 합성 반응의 사[0230]
이클수에 의해, 상기 연결 단위를 1개 포함하는 것이다. 열변성·재회합·DNA 합성 반응의 사이클수가 3회 이상
이면, 복수의 연결 단위가 늘어서는 연결 단위 집합체를 얻을 수 있다. 본 발명의 최종적인 목적은, 배열(A)－
표적 유전자-배열(B)로 표시되는 연결 단위를 얻는 것이다. 따라서, 본 발명의 제1 형태는, 연결 단위 집합체로
부터, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)로 이루어지는 연결 단위를 조제하는 공정을 다시 갖는 것이 바람직하다.
연결 단위를 조제하는 공정에는, 특별히 제한은 없지만, 예를 들어, 연결 단위 집합체에서, 연결 단위의 상류[0231]
및 하류를 특이적으로 절단하는 제한 효소를 사용하는 방법이나, 연결 단위 집합체를 주형으로서 연결 단위를
선택적으로 증폭하는 방법 등을 이용할 수 있다. 제한 효소를 사용하는 방법에서는, 연결 단위 집합체중의 배열
(A)－표적 유전자-배열(B)의 배열(A)의 외측과 배열(B)의 외측의 배열에 제한 효소 절단 배열을 도입하는 것으
로 실시할 수 있다.
연결 단위 집합체를 주형으로서 연결 단위를 선택적으로 증폭하는 방법은, 예를 들어, 연결용 2중 가닥 DNA 단[0232]
편(VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－VT1)의 전사 가닥의 배열(A) 또는 그 상류의 배열과 동일한 배열을 3＇측
에 포함된 미스매치 포워드 프라이머 및 배열(B) 또는 그 하류의 배열과 상보적인 배열을 3＇측에 포함된 미스
매치 리버스 프라이머를 이용한 PCR에 의해 실시할 수 있다. 이 미스매치 프라이머를 이용하여 연결 단위를 선
택적으로 증폭하기 위한 PCR의 스킴을 도 4에 표시된다. 도 4에 표시되는 바와 같이, 미스매치 프라이머를 이용
하면, 연결 단위 집합체로부터 분리된 연결 단위를 선택적으로 효율적으로 증폭할 수 있다. 연결 단위 집합체를
주형으로 하여 미스매치 포워드 프라이머 및 미스매치 리버스 프라이머를 이용한 최저 2 사이클의 PCR 반응에
의해 합성되는 연결 단위에는, 그 양말단 측에 주형인 연결용 2중 가닥 DNA 단편과 비상동적인 배열이
부가된다.
미스매치 프라이머를 이용한 PCR의 조건은 특별히 제한되지 않고, 통상 알려진 PCR 조건을 적용할 수 있지만,[0233]
예를 들어, 90~98℃를 20~60초, 55~65℃를 20~60초, 70~74℃를 3~5 분의 반응을 25~50 사이클 정도로 실시할
수 있다.
또한, 미스매치 영역을 그 5＇측에 갖지 않는 프라이머를 이용한 PCR의 스킴을 도 5에 표시된다. 도 5에 나타낸[0234]
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바와 같이, 이용하는 프라이머가 미스매치 프라이머가 아닌 경우, 연결 단위와 함께 연결 단위 집합체도 증폭되
게 되어, 연결 단위만을 선택적으로 증폭하는 것이 어렵다. 즉, 연결 단위 집합체를 주형으로 하여 포워드 프라
이머 및 리버스 프라이머를 이용한 최저 2 사이클의 PCR 반응에 의해 합성되는 연결 단위는, 주형인 연결 단위
집합체와 상동적이다. 3번째 이후의 PCR에서는 2개의 양식의 반응이 병행해서 진행된다. 하나는 합성된 연결 단
위에 포워드 프라이머 및 리버스 프라이머가 어닐링하여, 연결 단위가 증폭되는 반응이다.다른쪽은, 연결 단위
가 연결 단위 집합체에 어닐링한 결과 이형 2중 가닥 DNA가 형성되어 연결 단위 집합체가 증폭되는 반응이다.
후자의 반응이 전자의 반응에 비해 우위로 진행한 경우, 연결 단위를 효율적으로 증폭하는 것이 곤란해진다. 이
에 대해, 도 4에 나타낸, 미스매치 프라이머를 이용해 연결 단위 집합체로부터 합성된 연결 단위는, 그 양말단
측에 주형과 비상동적 배열을 가지기 때문에, 이것이 연결 단위 집합체에 어닐링하여 이형 2중 가닥 DNA가 형성
되어도 DNA 신장 반응이 일어나지 않고, 그 결과 연결 단위 집합체가 증폭될 것은 없다.
［본 발명의 제2 형태］ [0235]
본 발명의 제2 형태는, 상기 본 발명의 제1 형태에 있어서의 연결용 2중 가닥 DNA 단편을, 모식적으로-연결용[0236]
DNA 영역(1)-영역(1)및 영역(2)-연결용 DNA 영역(2)로 각각 표시되는 배열을 갖는 2개의 연결용 2중 가닥 DNA
단편(1) 및 2로 나누어 이용하는 방법이다. 이 방법에 의하면, 비표적 유전자의 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역
(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)가 연결한 연결 DNA 단편의 비특이적인 생성을 억제하고, 표적 유전자의
한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 한쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨, 목적으로 하는 연결 DNA 단편을
특이적으로 얻을 수 있다. 여기서 얻어진 연결 DNA 단편은, 모식적으로 연결용 DNA 영역(1)-영역(1)-표적 유전
자-영역(2)-연결용 DNA 영역(2)로 표시되는 배열을 갖는 것이다. 본 발명의 제2 형태에 대해 이용하는 「3＇말
단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」은, 본 발명의 제1 형태에 있어서의 것과 동일하다.
본 발명의 제2 형태에 대해 이용하는 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 상기와 같이 모식적으로 연결용 DNA 영역[0237]
(1)-영역(1)로 표시되는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)과 영역(2)-연결용 DNA 영역(2)로 표시되는 배열을 갖는 2
개의 연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)이다. 이하, 모식적으로 연결용 DNA 영역(1)-영역(1)로 표시되는 배열이 배열
(A)－VP1－VT1이며, 영역(2)-연결용 DNA 영역(2)로 표시되는 배열이 VT2－VP2－배열(B)인 실시형태에 대해서 설
명한다.
이 실시형태에서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 배열(A)－VP1－VT1(연결용 2중 가닥 DNA 단편(1)) 및[0238]
VT2－VP2－배열(B)(연결용 2중 가닥 DNA 단편(2))를, 적어도 2 사이클의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 제공
하고, 핵산 합성 산물로서 배열(A)－표적 유전자-배열(B)로 이루어지는 연결 단위를 하나 갖는 연결 DNA 단편을
얻는다.
상기 방법을 도 6의 스킴에 의해 설명한다. 또한, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 적어도 2회의 열변성[0239]
·재회합·DNA 합성 반응에 대해서는, 상기 본 발명의 제1 형태의 실시형태에 대해 설명한 것과 같다.
배열(A)－VP1－VT1는, 임의의 배열(A), 영역 VP1 및 영역 VT1를 이 순서로 가지며, 영역 VT1가 한쪽의 말단에[0240]
있고, 영역 VP1 및 영역 VT1는, 각각, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 배열 P1에 상동적인 염기 배열 및
배열 T1에 상동적인 염기 배열로부터 된다. VT2－VP2－배열(B)는, 영역 VT2, 영역 VP2 및 임의의 배열(B)를 이
순서로 가지며, 영역 VT2가 한쪽 말단에 있어, 영역 VP2 및 영역 VT2는, 각각, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자
단편의 배열 P2에 상동적인 염기 배열 및 배열 T2에 상동적인 염기 배열로 이루어진다.
＜배열(A)－VP1－VT1＞ [0241]
배열(A)－VP1－VT1는, 임의의 배열(A), 영역 VP1 및 영역 VT1를 이 순서로 가진다. 다만, 영역 VT1는 연결용 2[0242]
중 가닥 DNA 단편의 한쪽의 말단에 배치되어 있다. 배열(A)－VP1－VT1에 있어서의, 배열(A), 영역 VP1 및 VT1에
대해서는, 상기 제 1 형태의 실시형태의 기재를 참조할 수 있다. 배열(A)－VP1－VT1에는, 배열(A)의 상류, 배열
(A)와 영역 VP1와의 사이, 영역 VP1와 VT1와의 사이에, 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 제공한 경우에 3＇돌
출 말단을 갖는 2중 가닥 DNA 단편과의 어닐링을 방해하지 않는 범위에 대해 스페이서-배열 등의 배열이 있어도
된다. 배열(A)－VP1－VT1는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 배열(A)－VP1－VT1를 인서트로서 함유하는 핵
외 유전자로부터 제한 효소 처리에 의해, 배열(A)－VP1－VT1를 분리함으로써 얻을 수 있다. 또, 배열(A)－VP1－
VT1는, 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편 A를 인서트로서 함유하는 핵외 유전자를 주형으로 하고, 배열(A)의 상
류의 배열과 같은 배열의 일부를 포함한 포워드 프라이머와 영역 VT1의 한쪽 말단측의 배열과 상보적인 배열의
일부를 포함한 리버스 프라이머를 이용한 PCR에 제공하는 것으로 얻을 수도 있다.
＜VT2－VP2－배열(B)＞ [0243]
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VT2－VP2－B는, 배열(B), 영역 VP2 및 영역 VT2를 이 순서로 갖는다. 다만, 영역 VT2는 VT2－VP2－배열(B)의[0244]
한편의 말단에 배치되어 있다. VT2－VP2－배열(B)에 있어서의, 배열(B), 영역 VP2 및 VT2에 대해서는, 상기 제
1 형태의 실시형태의 기재를 참조할 수 있다. VT2－VP2－배열(B)에는, 배열(B)의 상류, 배열(B)와 영역 VP2와의
사이, 영역 VP2와 VT2와의 사이에, 열변성·재회합·DNA 합성 반응에 제공했을 경우에 3＇돌출 말단을 갖는 2중
가닥 DNA 단편과의 어닐링을 방해하지 않는 범위에 대해 스페이서-배열 등의 배열이 있어도 된다. VT2－VP2－배
열(B)는, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, VT2－VP2－배열(B)를 인서트로서 함유하는 핵외 유전자로부터 제
한 효소 처리에 의해, VT2－VP2－배열(B)를 분리함으로써 얻을 수 있다. 또, VT2－VP2－배열(B)는, VT2－VP2－
배열(B)를 인서트로서 함유하는 핵외 유전자를 주형으로 하고, 배열(A)의 상류의 배열과 같은 배열의 일부를 포
함한 포워드 프라이머와 영역 VT2의 한편의 말단측의 배열과 상보적인 배열의 일부를 포함한 리버스 프라이머를
이용한 PCR에 제공하는 것으로 얻을 수도 있다.
(1) 열변성·재회합·DNA 합성 반응(1)[0245]
1 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 배열(A)－VP1－VT1,[0246]
및 VT2－VP2－배열(B)를 이용해 열변성·재회합·DNA 합성 반응을 실시한다. 열변성 후의 어닐링에 의해 3＇말
단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 안티센스 가닥의 배열 P1＋T1와 배열(A)－VP1－VT1의 한쪽 가닥(전사 가닥)의
영역 VP1＋VT1와의 사이에 안정된 2중 가닥 형성이 일어난다. 동일하게 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의
전사 가닥의 배열 P2＋T2와 VT2－VP2－배열(B)의 한쪽의 가닥(안티센스 가닥)의 영역 VP2＋VT2와의 사이에 안정
된 2중 가닥 형성이 일어난다. 그 후의 DNA 폴리머라제에 의한 DNA 합성 반응에 의해서, 배열(A)－VP1－VT1의
영역 VT1를 기점으로서 핵산이 신장 한 핵산 신장물(4)이 합성된다. 또, VT2－VP2－배열(B)의 영역 VT2를 기점
으로서 핵산이 신장한 핵산 신장물(3)이 합성된다. 한편, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편에는 배열 P1 및
P2의 3＇말단에 적어도 1개의 뉴클레오티드가 부가되고 있기 때문에, 배열 P1 및 P2를 기점으로서 핵산은 신장
하지 않는 것은 상기한 바와 같다.
(2)열변성·재회합·DNA 합성 반응(2)[0247]
2 사이클째의 열변성·재회합·DNA 합성 반응에서는, 열변성 후의 어닐링에 의해서, 상기 핵산 신장물(3) 및[0248]
(4)의 사이에 2중 가닥이 형성되면, 계속되는 DNA 합성 반응에 의해서, 서로를 주형으로 하고, 양쪽 모두의 3＇
말단으로부터 핵산이 신장하여, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)가 이 순서로 결합된 연결 단위를 1개 포함한 연
결 DNA 단편이 핵산 합성 산물로서 얻을 수 있다.
(3)열변성·재회합·DNA 합성 반응(3 사이클째 이후)[0249]
도 6의 스킴에는 나타내지 않지만, 열변성·재회합·DNA 합성 반응을 3 사이클째 이후에도 실시할 수 있고, 3[0250]
사이클째 이후의 열변성·재회합·DNA 합성 반응을 실시하는 것으로, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)가 이 순서
로 결합된 연결 단위를 1개 포함한 연결 DNA 단편이 핵산 합성 산물로서 얻을 수 있다. 본 발명의 제2 형태에서
는, 본 발명의 제1 형태에 있어서와 같이, 연결용 2중 가닥 DNA 단편으로서 VT2－VP2－배열(B)－배열(A)－VP1－
VT1와 같은 배열(B)와 배열(A)가 연결한 배열의 단편을 이용하지 않기 때문에, 배열(A)－표적 유전자-배열(B)가
이 순서로 결합된 연결 단위를 복수 포함한 연결 단위 집합체가 합성되는 것은 없다.
＜배열(A)－표적 유전자-배열(B)로부터 되는 연결 단위＞ [0251]
본 발명의 제2 형태에서도, 본 발명의 제1 형태와 동일하게, 핵산 합성 산물로서 얻은 연결 DNA 단편으로부터,[0252]
배열(A)－표적 유전자-배열(B)로부터 완성되는 연결 단위를 조제하는 공정을 설치하는 것이 바람직하다. 이러한
연결 단위를 조제하는 공정은, 특별히 제한되지 않지만, 예를 들어, 배열(A) 및 B의 상류 및 하류를 특이적으로
인식하는 제한 효소를 사용하는 방법이나, 연결 단위를 선택적으로 증폭하는 방법 등에 의해 실시할 수 있다.
연결 DNA 단편으로부터 상기 방법에 의해 분리된 연결 단위를, 발현 유니트로서 숙주 세포에 도입하여 표적 유[0253]
전자가 코드하는 단백질을 숙주 세포 내에서 선택적으로 발현시키는 경우, 배열(A)에 프로모터 배열, 배열(B)에
폴리 A 부가배열을 이용할 수 있다. 발현 유니트를 작성하는 경우는, 숙주 세포내에서의 표적 유전자의 발현을
방해하지 않는 범위에서, 각 배열사이, 배열(A)의 상류, 배열(B)의 하류에, 스페이서-배열 등의 배열이 있어도
된다.
［본 발명의 제3 형태］ [0254]
본 발명의 제3 형태는, 상기 본 발명의 제2 형태에 있어서의, 2개로 나눈 어느 하나의 한쪽 연결용 2중 가닥[0255]
DNA 단편, 모식적으로 영역(1)-연결용 DNA 영역(1)또는 연결용 DNA 영역(2)-영역(2)로 표시되는 배열을 이용하
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는 방법이다. 이 방법에서는, 비표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1) 또는 (2)를 연결시킨 한쪽 편
연결 DNA 단편의 비특이적인 생성을 억제하고, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1) 또는 (2)를 연결
시킨, 목적으로 하는 편측 연결 DNA 단편을 특이적으로 얻을 수 있다. 본 발명의 제3 형태에 대해 이용하는 「3
＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편」은, 본 발명의 제1 형태에 있어서의 것과 같은 표적 유전자 배열의 양쪽 모
두의 말단 측에 회합 가능한 영역과 돌출 말단을 갖는 것일 수도 있지만, 표적 유전자 배열의 한쪽 말단측에만
회합 가능한 영역을 가지며, 또한 상기 영역은 적어도 일부의 염기 배열이 표적 유전자 배열에 포함되는 고유의
염기 배열이며, 상기 회합 가능한 영역의 3＇말단에 1 뉴클레오티드 이상의 돌출 말단을 갖는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편일 수도 있다. 본 발명의 제3 형태에서는, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 갖는 한쪽 말
단측의 회합 가능 영역과 돌출 말단만을 이용하므로, 후자의 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편을 이용하는 것
이 바람직하다.
본 발명의 제3 형태에 대해 이용하는 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 상기와 같이 모식적으로 영역(1)-연결용 DNA[0256]
영역(1)로 표시되는 배열 또는 연결용 DNA 영역(2)-영역(2)로 표시되는 배열을 갖는 2개의 단편이다. 이하, 모
식적으로 영역(1)-연결용 DNA 영역(1)로 표시되는 배열이 배열(A)－VP1－VT1인 실시형태에 대해 설명한다. 연결
용 DNA 영역(2)-영역(2)로 표시되는 배열이 VT2－VP2－배열(B)인 실시형태는, 모식적으로 영역(1)-연결용 DNA
영역(1)로 표시되는 배열이 배열(A)－VP1－VT1인 실시형태와 동일하게, 실시할 수 있다.
본 발명의 제3 형태의 상기 실시형태에서는, 배열(A)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편(배열(A)－VP1－VT1)을[0257]
표적 유전자 단편의 한쪽 말단 측에 선택적으로 연결시키는 방법이 제공된다. 이 방법은, 상기 3＇말단 돌출 2
중 가닥 유전자 단편(다만, 3＇돌출 말단은 한쪽 가닥의 상기 배열 P1의 3＇말단 측에 있으면 좋다)과, 상기 배
열(A)를 갖는 DNA 단편을 이용하여 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 상기 배열(A)를 갖는 연결용 2
중 가닥 DNA 단편의 혼합물을, 열변성과 재회합의 뒤, 핵산 합성 반응에 제공한다. 이 조작에 의해, 한쪽 가닥
의 상기 배열 P1의 3＇말단에 돌출 말단으로서 1 뉴클레오티드 이상의 배열을 가지며, 그 가닥의 5＇말단에 배
열 P2에 유래하는 배열을 갖는 외가닥 DNA와(2중 가닥 DNA 단편의 안티센스 가닥), 다른쪽의 가닥의 5＇말단 측
에 상기 배열(A)에 유래하는 배열 및 그 3＇말단에 배열 VT1에 유래하는 배열을 갖는 외가닥 DNA(연결용 2중 가
닥 DNA의 전사 가닥)가 회합한 이형 2중 가닥 DNA 산물을 얻는다. 이어서, 이 이형 2중 가닥 DNA 산물을 주형으
로서 2중 가닥 유전자 단편의 안티센스 가닥의 5＇말단측의 배열을 갖는 리버스 프라이머와 연결용 2중 가닥
DNA 단편의 전사 가닥의 5＇말단측의 배열을 갖는 포워드 프라이머를 이용한 폴리머라제 연쇄 반응을 실시한다.
이것에 의해, 배열(A) 및 표적 유전자의 배열이 연결된 2중 가닥 DNA 단편(편측 연결 DNA 단편)을 얻는다(도 7
의 스킴을 참조).
열변성·재회합·DNA 합성 반응에 대해서는, 상기 본 발명의 제1 형태 실시형태에 대해 설명한 것과 동일하다.[0258]
배열(A)－VP1－VT1는, 상기 본 발명의 제2 형태의 실시형태에 대해 설명한 것과 동일하다.
연결용 DNA 영역(2)-영역(2)로 표시되는 배열이 VT2－VP2－배열(B)인 실시형태는, 모식적으로 영역(1)-연결용[0259]
DNA 영역(1)로 표시되는 배열이 배열(A)－VP1－VT1인 실시형태와 동일하게, 실시할 수 있다. 또, VT2－VP2－배
열(B)는, 상기 본 발명의 제2 형태의 실시형태에 대해 설명한 것과 동일하다.
본 발명의 연결 DNA 단편의 제조 방법에 대해서는, 상술한 바와 같이, 상기 표적 유전자가 항체 유전자 또는 T[0260]
세포 수용체 유전자이며, 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 상기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전
자에 유래하는 배열을 포함하며 및 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 상기 배열(A)를 갖는 연결용 2중 가닥
DNA 단편에 있어서의 상기 영역 VP1 및 영역 VT1는, 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유
래하지 않는 배열을 갖는 것일 수 있다. 또한, 기표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에서, 상
기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편이 상기 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 배열을 포함
하며 및 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 상기 배열(B)를 갖는 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 있어서의 상기
영역 VP2 및 영역 VT2는, 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자에 유래하는 또는 유래하지 않는 배열일 수 있
다. 본 발명에서는, 이와 같은 표적 유전자를 이용하여 제조된 연결 DNA 단편을 이용하여 항체 또는 T세포 수용
체를 제조하는 방법도 포함한다.
표적 유전자가 항체 유전자 또는 T세포 수용체 유전자인 연결 DNA 단편을 이용하여 항체 또는 T세포 수용체를[0261]
제조하는 방법은, 상법, 예를 들면, 표적 유전자를 포함한 연결 DNA 단편을 숙주 세포에 도입하여, 이 숙주 세
포를 배양하고 항체 등을 산생시킴으로써 실시할 수 있다.
상술한 바와 같이 본 발명은, 상기 본 발명의 제1 형태~제3 형태로 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단[0262]
편, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 및 이들 조합체, 또 이들을 포함한 키트를 포함한다. 본 발명 제1 형태~제3 형태
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로 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편은 상술한 바와 같다. 또한, 조합
체는, 제1 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체, 제2
형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체 및 제3 형태에
서이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체로 이루어진다.
제1 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체에[0263]
대해서는, 표적 유전자의 양쪽 모두의 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 연결 DNA 단편을 양호하게 제조한다는
관점에서는,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의[0264]
한쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연
결용 2중 가닥 DNA 단편의 한쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한편의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0265]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0266]
의 다른쪽 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열
이 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0267]
반응에서 가닥 신장 기능을 갖지 않다는 것이 바람직하다.
제2 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체에[0268]
대해서는, 표적 유전자의 한편의 측에 연결용 DNA 영역(1), 다른쪽 측에 연결용 DNA 영역(2)를 연결시킨 연결
DNA 단편을 양호하게 제조한다는 관점에서는,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0269]
(1)의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로부터 되지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중
가닥 DNA 단편(1)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한편의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0270]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않고,
(3-3) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단[0271]
편(2)의 말단의 회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이
연결용 2중 가닥 DNA 단편(2)의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-4) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 다른쪽의 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성[0272]
반응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않는 것이 바람직하다.
제3 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편과 연결용 2중 가닥 DNA 단편과의 조합체에[0273]
대해서는, 표적 유전자의 한쪽 측에 연결용 DNA 영역을 연결시킨 편측 연결 DNA 단편을 양호하게 제조한다고 하
는 관점에서는,
(3-1) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역은, 상기 연결용 2중 가닥 DNA 단편의[0274]
회합 가능한 영역과 상동적인 염기 배열로 이루어지지만, 3＇돌출단이 부가된 말단측의 배열이 연결용 2중 가닥
DNA 단편의 회합 가능한 영역에서는 연결용 DNA 영역과 결합하는 측이며,
(3-2) 상기 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편의 한쪽 회합 가능한 영역으로부터의 돌출 말단은, DNA 합성 반[0275]
응에 대해 가닥 신장 기능을 갖지 않다는 것이 바람직하다.
본 발명의 키트는, 상기 본 발명의 제1 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 연결용 2중 가[0276]
닥 DNA 단편 또는 이들 조합체를 포함하는 것이거나, 상기 본 발명의 제2 형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중
가닥 유전자 단편, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 이들 조합체를 포함하는 것이거나, 또는 상기 본 발명의 제3
형태에서 이용되는 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편, 연결용 2중 가닥 DNA 단편 또는 이들 조합체를 포함하
는 것이다. 본 발명의 키트에 상기 이외에, 3＇말단 돌출 2중 가닥 유전자 단편 및 연결용 2중 가닥 DNA 단편을
이용하고, 열변성, 재회합 및 DNA 합성 반응을 실시하여 연결 DNA 단편을 얻기 위해서 이용하는 완충액, DNA 폴
리머라제 등의 DNA 합성용 효소 또는 효소 함유 완충액 및 키트의 사용 설명서를 포함할 수 있다.
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이하, 본 발명을 실시예에 의해 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이들 실시예에 제한되는 것은 아니다.[0277]
(실시예)[0278]
[예 1］[0279]
1. 미정제 표적 유전자 단편의 발현 유니트로의 특이적 변환[0280]
표적 유전자 단편(1)(도 10을 참조)은, 인간 면역 글로블린 γ가닥의 가변 영역과 일부의 정상 영역을 갖는 683[0281]
bp의 DNA 단편이며, 그 양단에 PCR 증폭을 위한 프라이머 A：5＇－CTTCGAATTCTGCAGTCGACGGTACCGCGGGCCCGGGA－3
＇및 프라이머 B：5＇－AGCCGGGAAGGTGTGCACGCCGCTG－3＇의 배열을 가진다. 또 내부 배열로서 프라이머 A의 안쪽
에 폴리 dC배열, 프라이머 B배열의 안쪽에 면역 글로블린 γ가닥 정상 영역 유래 배열을 각각 가진다. 도 10에
서, 증폭에 이용한 프라이머 A, B의 위치를 화살표로 표시된다.
비표적 유전자 단편(2)(도 11을 참조)는 628 bp의 GPF 유전자에 유래하는 DNA 단편으로, 그 양단에 PCR 증폭을[0282]
위해서 이용하는 프라이머 A배열과 프라이머 B배열을 갖는다. 양프라이머 배열의 안쪽에는 내부 배열은 존재하
지 않고, GFP 유전자 유래 배열이 존재한다.
표적 유전자 단편(1) 및 비표적 유전자 단편(2) 각각이 삽입된 핵외 유전자 pUC119를 주형으로 하고, 프라이머[0283]
A 및 B를 이용하여 PCR 반응을 실시하여, 표적 유전자 단편(1) 및 비표적 유전자 단편(2)를 각각 증폭하였다.
PCR 반응은, 50㎕의 반응계에, 주형 핵외 유전자 DNA 2ng, 각 프라이머 10 p㏖, dNTP 10n㏖를 더하여 다카라 바
이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라제를 이용하여 94℃ 30초 -68℃ 40초의 반응을 30 사이클 실시하였다.
2. PCR 산물의 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 반응[0284]
PCR 후의 반응액을 각각 1㎕튜브에 분주하고, 이것에 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스 퍼라아제(terminal[0285]
deoxynucleotidyl transferase)를 10 unit 더하여 37℃에서 30분 반응시키고 그 후 94℃에서 5분간 가열하는
것으로 효소 반응을 정지시켰다. 이 반응에 의해, DNA 단편의 양 3＇말단에 폴리뉴클레오티드가 부가되었다.음
성 컨트롤로서 터미널 데옥시 뉴클레오티딜 트랜스 퍼라제를 가하지 않는 반응을 표적 유전자 단편(1) 및 비표
적 유전자 단편(2)의 각각에 대해 동일하게 실시하였다.
3.인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 작성[0286]
pMiniCMV－hIgG는, CMV 프로모터, 멀티 클로닝 사이트, 폴리 dC/dG 배열, pUC119 복제 개시점, 암피실린 내성[0287]
유전자, 인간 면역 글로블린 γ가닥 정상 영역, SV40 폴리 A부가 시그널을 갖는 전체 길이 3533 bp의 핵외 유전
자이다.
pMiniCMV－hIgG를 EcoRV로 절단 후, 이것을 주형으로서 프라이머 C5＇－GGGGGGGGGGGGGGGGGATCCCGG－3＇및 프라[0288]
이머 D5＇－CGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAG－3＇을 이용한 PCR법에서 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단
편의 조제를 실시하였다. PCR 반응은 다카라 바이오의 프라임 스타 DNA 폴리머라제를 이용하여 94℃ 40초, 60℃
40초, 72℃ 5분의 사이클을 30회 실시하는 것으로 증폭 반응을 실시하였다. 증폭된 DNA 단편은 스핀 컬럼법에
의해 정제하여, 10ng/ℓ의 농도에 조제하였다. 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편은, 그 일단에, 5
＇－RACEPCR법에 의해 증폭된 인간 면역 글로블린 γ가닥만과, 특이적인 상보가닥을 형성하는 영역으로서 인간
면역 글로블린 γ가닥 정상 영역 유래의 내부 배열, 그 하류에 유전자 증폭에 이용된 프라이머 B배열과 상보가
닥을 형성하는 배열을 갖는다(도 12를 참조).
이미 한쪽단에는 터미널 데옥시뉴클레오티딜 트랜스 퍼라제 반응에 의해 폴리 dC배열이 부가된 cDNA에 유래하는[0289]
5＇－RACE 증폭 산물만과 특이적으로 상보가닥을 형성하는 영역으로서 폴리 dC/dG 배열, 그 상류에는 5＇－
RACEPCR법으로 이용된 프라이머 A배열과 상보가닥을 형성하는 배열이 존재한다(도 13을 참조). 표적 유전자 단
편(1)과는 도 12중의 음영부 전체와 상보가닥을 형성하는 것이 가능하지만, 비표적 유전자 단편(2)는 도 12중의
음영부 중 프라이머 B 및 프라이머 A상보 가닥 형성 배열만과 상보가닥을 형성하는 것이 가능하다.
4.인간 γ가닥 유전자 발현 유니트의 증폭[0290]
상기에서 조제한 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 DNA 단편(1) 및 (2)에, 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥[0291]
DNA 단편을 10ng, 프라이머를 10p㏖, dNTP를 10 n㏖ 더하여 다카라 바이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라제
를 포함한 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃을 4 분의 반응을 5 사이클, 계속 94℃를 40초, 60℃을 40초,
72℃를 4 분의 반응을 30 사이클 실시하였다. 이용한 프라이머 중, 프라이머 E： 5＇－
AGAGAAGATCTTAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG－3＇은 그 5＇말단에 미스매치 배열을 가지며, 인간 γ가닥 유전자 연
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결용 2중 가닥 DNA 단편의 CMV 프로모터 상류 부근에 어닐링한다. 프라이머 F：5＇－
AAGGAAGATCTGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG－3＇은 그 5＇말단에 미스매치 배열을 가지며, 인간 γ가닥 유전자 연
결용 2중 가닥 DNA 단편의 SV40 폴리 A 부가배열 하류 부근에 어닐링한다.
동일하게 음성 컨트롤로서 조제한 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가를 실시하지 않은 표적 유전자 단편(1) 및 비[0292]
표적 유전자 단편(2)에, 인간 γ가닥 유전자 연결용 DNA 단편 10ng, 프라이머 E 및 F를 10p㏖, dNTP를 10n㏖를
더하여 다카라 바이오의 PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃을
4 분의 반응을 5 사이클, 계속 94℃를 40초, 60℃을 40초, 72℃를 4 분의 반응을 30 사이클 실시하였다. PCR 반
응액에서 각각 2㎕를 취하여 아가로스겔 전기영동법에서 발현 유니트의 증폭을 확인하였다(도 1을 참조).
그 결과, 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 표적 유전자 단편(1)은 특이적으로 발현 유니트에 변환되어 약 2.5 kb[0293]
의 PCR 산물의 증폭이 확인되었다. 이것에 대해 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 비표적 유전자 단편(2)는 발현
유니트에 변환되지 않았다. 또 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 반응을 실시하지 않았던 표적 유전자 단편(1)은
발현 유니트에 변환되었지만, 비표적 유전자 단편(2)도 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편에 연결되
었다. 이상의 결과로부터, 표적 유전자 단편에 대한 내부 배열을 갖는 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편과 3＇
말단 폴리뉴클레오티드 부가 반응을 실시한 유전자 단편을 이용하는 것으로, 표적으로 하는 인간 면역 글로블린
가변 영역과 정상 영역의 일부를 갖는 DNA 단편을 정제하지 않고 이 발현 유니트로 변환하는 것이 가능하다라고
하는 것이 판명되었다.
［예 2］[0294]
5＇말단 미스매치 프라이머를 이용한 효율적인 연결 단위(발현 유니트)의 증폭[0295]
［예 1］의 2에서 조제한 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 표적 유전자 DNA 단편(1)에, 3에서 조제한 인간 γ가[0296]
닥 유전자 연결용 DNA 단편을 더해 94℃를 40초, 70℃을 4 분의 반응을 5 사이클 실시하여 연결 2중 가닥 DNA
집합체를 합성하였다. 이것에 프라이머 E 및 F 또는 G 및 H를 더하여 94℃를 40초, 60℃를 40초, 72℃를 4 분의
반응을 30 사이클 행동 발현 유니트의 증폭을 시도하였다. 프라이머 G：5＇－TAGTTATTAATAGTAATCAATTACGG－3＇
및 프라이머 H：5＇－TGGACAAACCACAACTAGAATGCAGTG－3＇은, 주형인 인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA
단편에 대해 100%의 상동성을 갖는다.
PCR의 결과 프라이머 G 및 H를 이용했을 경우에서는, 목적으로 하는 발현 유니트의 증폭 외에 연결 단위 집합체[0297]
의 증폭이 인정되었다(도 2를 참조). 이것에 대해 5＇말단에 미스매치 배열을 갖는 프라이머 E 및 F를 이용한
경우에서는, 효율적인 발현 유니트의 증폭이 인정되었다.
［예 3］[0298]
인간 말초혈 플라스마 세포로부터 증폭된 미정제의 인간 γ,κ가닥 면역 글로블린 유전자 단편과 인간 γ 및 κ[0299]
가닥 유전자 연결용 DNA 단편을 이용하여 인간 면역 글로블린 발현 유니트를 작성하고, 이것을 배양 세포에 도
입하여 인간 항체를 작성하였다.
1.5＇－RACEPCR법을 이용한 인간 면역 글로블린 γ 및 κ가닥 가변 영역 유전자 단편의 증폭 [0300]
인간의 말초혈에 의해 조정한 플라스마 세포를 1 개씩 2개의 튜브에 단리하고, 이것에 올리고 dT25가 결합한 자[0301]
기 비즈(다이나피즈) 3㎍가 들어간 세포 용해액 3㎕(100 mM TrisHCl(pH7.5), 500mM LiCl, 1% 도데실 황산
Li(LiDS), 5mM dithiothreitol)에 가세하여 세포내의 mRNA를 자기 비즈에 결합시켰다. 이어서 자기 비즈를, 3
㎕의 mRNA 세정용 용액A(10mM TrisHCl(pH 7.5), 0.15M LiCl, 0.1% LiDS), 계속 되어 3㎕의 mRNA 세정용 용액
B(75mM KCl, 3mM MgCl2, 0.1% TritonX, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase inhibitor)에서 1회 세정한 후,
cDNA 합성을 실시하였다. 세정 후의 자기 비즈에, cDNA 합성용 용액 3㎕(50mM TrisHCl(pH8.3), 75 mM KCl, 3mM
MgCl2, 0.1% TritonX－100, 0.5mM dNTP, 5mM DTT, 2unit RNase inhibitor, l0unit Super Scriptlll Reｖ
ersetranscriptase(Inｖitrogen)를 가하여 50℃에서 1시간 반응시켰다. 이어서, 자기 비즈를 3＇테이링 세정 용
액 3㎕(50mM 인산 칼륨(pH 7.0), 0.5mM dGTP, 0.1% TritonX－100, 4mM 염화 마그네슘)로 세정하고, 새롭게 3＇
테이링 반응 용액 3㎕(50mM 인산 칼륨(pH 7.0), 0.5mM dGTP, 0.1% TritonX－100, 4mM 염화 마그네슘, terminal
deoxynucleotidyl transferase 10U)를 더하여 37℃에서 30분간 반응을 실시하였다.
자기 비즈를 3㎕의 TE용액(10mM TrisHCl(pH 7.5), 1mM EDTA, 0.1% TritonX－100)에서 세정 후, 5＇－RACEPCR법[0302]
을 이용하여 인간 면역 글로블린 γ가닥 및 κ가닥 유전자의 증폭을 실시하였다. 1회째의 PCR 반응은, 자기 비
즈에 25㎕의 PCR 반응 용액(프라이머 I, J 및 K를 각 l0p㏖, dNTP 10n㏖, 다카라 바이오 PrimeSTAR 내열성 DNA
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폴리머라제 lU 함유)을 더해 94℃ 30초 -68℃ 40초의 반응을 35 사이클 실시하였다. 프라이머 I의 배열은 5＇－
CGGTACCGCGGGCCCGGGATCCCCCCCCCCCCCDN－3＇이며, TdT에 의해 cDNA의 3＇말단에 부가된 폴리 G에 어닐링한다.
프라이머 J의 배열은 5＇－ACGCTGCTGAGGGAGTAGAGTCCTGAG－3＇이며, 인간 면역 글로블린 γ가닥 유전자의 정상
영역에 유래한다. 프라이머 K의 배열은 5＇－CTTTGGCCTCTCTGGGATAGAAGTT－3＇이며, 인간 면역 글로블린 κ가닥
유전자의 정상 영역에 유래한다.
반응 후 PCR 용액에 물 225㎕를 더하여 10배 희석한 용액 1㎕를 주형으로 하고, 프라이머 A와 프라이머 B를 이[0303]
용하여 1회째의 PCR와 같은 조건으로 인간 면역 글로블린 γ가닥 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을
실시하였다. 이와 같이 프라이머 A와 프라이머 L：5＇－ACAACAGAGGCAGTTCCAGATTTCAACTGC－3＇을 이용해 인간 면
역 글로블린 κ가닥 유전자의 가변 영역의 증폭 반응을 실시하였다.
그 결과 실험에 이용한 2개의 형질 세포(세포 1및 세포 2)의 각각으로부터 약 800 bp의 γ가닥의 가변 영역과[0304]
일부의 정상 영역, 및 약 600 bp의 κ가닥의 가변 영역과 일부의 정상 영역의 증폭이 인정되었다(도 15를 참
조).
2. PCR 산물의 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 반응[0305]
1.에서 조제한 각 PCR 산물 1㎕에, 터미널 데옥시 뉴클레오티드 트랜스 퍼라제를 10 unit 더하여 37℃에서 30분[0306]
반응시키고, 그 후 94℃에서 5분간 가열하는 것으로 효소 반응을 정지시켰다.
3. 인간 γ가닥 유전자 및κ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편의 조제[0307]
인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편은 예 1에서 조제한 것을 이용하였다.[0308]
pMiniCMV－hIgK는, CMV 프로모터, 멀티 클로닝 사이트, 폴리 dC/dG배열, pUC119 복제 개시점, 암피실린 내성 유[0309]
전자, 인간 면역 글로블린 κ가닥 정상 영역, SV40 폴리 A부가 시그널을 갖는 전체 길이 2976 bp의 핵외 유전자
이다.
pMiniCMV－hIgK를 EcoRV로 절단 후, 이것을 주형으로서 프라이머 C 및 프라이머 M：5＇－[0310]
CATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAG－3＇을 이용한 PCR법에서 인간 κ가닥 유전자 연결용 DNA 단편(도 16을 참조)의 조
제를 실시하였다. PCR 반응은 다카라 바이오의 프라임 스타 DNA 폴리머라제를 이용하여 94℃ 40초, 60℃ 40초,
72℃ 5분의 사이클을 30회 실시하는 것으로 증폭 반응을 실시하였다. 증폭된 DNA 단편은 스핀 컬럼법에 의해 정
제하고, 10 ng/ℓ의 농도에 조제하였다.
4. 인간 γ및κ가닥 발현 유니트의 증폭[0311]
상기에서 조제한 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 인간 γ가닥 유전자 용액에, 3.에서 조제한 인간 γ가닥 유전[0312]
자 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 10 ng, 프라이머를 10p㏖, dNTP를 10n㏖를 더하여 다카라 바이오의 PrimeSTAR
내열성 DNA 폴리머라제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃를 4 분의 반응을 5 사이클, 계속 94
℃를 40초, 60℃을 40초, 72℃를 4 분의 반응을 30 사이클 실시하였다. 이용한 프라이머는, 프라이머 E 및 프라
이머 F이다.
동일하게 상기에서 조제한 3＇말단 폴리뉴클레오티드 부가 인간 κ가닥 유전자 용액에, 3에서 조제한 인간κ가[0313]
닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편을 10 ng, 프라이머를 10 p㏖, dNTP를 10 n㏖를 더하여 다카라 바이오의
PrimeSTAR 내열성 DNA 폴리머라제를 이용하여 25㎕의 반응액에서, 94℃를 40초, 70℃를 4분의 반응을 5 사이클,
계속 94℃를 40초, 60℃를 40초, 72℃를 4 분의 반응을 30 사이클 실시하였다. 이용한 프라이머는 프라이머 E
및 프라이머 F이다.
증폭된 DNA 단편을 에탄올 침전에 의해 정제하여, 25㎕의 PBS에서 용해하였다. 이것에 의해 각각 1㎕를 취하여[0314]
아가로스겔 전기영동법에서, 세포 1 및 세포 2에서 얻어진 κ 및 γ가닥 면역 글로블린 유전자 단편의 발현 유
니트로의 변환을 확인하였다(도 17을 참조).
5. 배양 세포에의 인간 면역 글로블린 발현 유니트의 도입에 의한, 항GFP 항체의 발현[0315]
4.에서 조제한 인간κ및γ가닥 발현 유니트 각 5㎕(약 0.25㎍)에, DMEM 배지 90㎕ 및 FuGENE HD 트랜스펙션[0316]
(Transfection) 시약 2㎕를 더하여 20분 실온에서 방치 후, 24 구멍 배양 접시에 배양된 293 FT세포에 유전자
도입을 실시하였다. 3일간 배양을 실시한 후의 배양 상등액을 회수하여, 인간 항체의 산생을 샌드위치 ELISA법
에서 측정하였다(도 18을 참조). ELISA는 양 항인간 항체 1㎍를 96혈 플레이트 저면에 고정화하고, 이것에 세포
상등액을 100㎕ 더하여 실온에서 3시간 항원 항체 반응을 실시하였다. 플레이트에 결합한 재조합 인간 항체를,
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서양 겨자무 과산화효소(horseradish peroxidase)가 결합한 양 항인간 항체를 이용하여 검출을 실시하였다. 그
결과, 세포 1 유래의 인간 γ및 인간κ가닥 유전자 발현 유니트(컬럼 1), 및 세포 2 유래의 인간 γ및 인간κ가
닥 유전자 발현 유니트(컬럼 2)을 도입한 293 FT세포의 배양 상등액 중에 재편성 인간 항체가 검출되었다.
한편, 음성 컨트롤인 유전자 도입을 하고 있지 않는 세포 상등액 중(컬럼 3)에는 재편성 인간 항체가 검출되지
않았다.
실시예에서 이용한 각 DNA 단편과 배열표의 배열 번호 1과의 관계는, 이하와 같다.[0317]
배열표의 배열 번호 1：표적 유전자 단편(1)[0318]
[0319]
배열표의 배열 번호 2：프라이머 A [0320]
배열표의 배열 번호 3：프라이머 B [0321]
배열표의 배열 번호 4：비표적 유전자 단편(2)[0322]
[0323]
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배열표의 배열 번호 5：pMiniCMV-hIgG[0324]
[0325]
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배열표의 배열 번호 6：프라이머 C [0326]
배열표의 배열 번호 7：프라이머 D [0327]
배열표의 배열 번호 8：인간 γ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0328]
[0329]
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배열표의 배열 번호 9：프라이머 E [0330]
배열표의 배열 번호 10：프라이머 F [0331]
배열표의 배열 번호 11：프라이머 G [0332]
배열표의 배열 번호 12：프라이머 H [0333]
배열표의 배열 번호 13：프라이머 I [0334]
배열표의 배열 번호 14：프라이머 J [0335]
배열표의 배열 번호 15：프라이머 K [0336]
배열표의 배열 번호 16：프라이머 L [0337]
배열표의 배열 번호 17：프라이머 M [0338]
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배열표의 배열 번호 18：pMiniCMV-hIgK[0339]
[0340]
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배열표의 배열 번호 19：인간 κ가닥 유전자 연결용 2중 가닥 DNA 단편[0341]
[0342]
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도면
도면1
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도면2
도면3
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도면4
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도면5
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도면8
도면9
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도면10
도면11
도면12
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도면13
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도면14
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도면15
도면16
도면17
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도면18
서 열 목 록
SEQUENCE LISTING
<110> NATIONAL UNIVERSITY CORPORATION UNIVERSITY OF TOYAMA

<120> Method of manufacturing an expression unit comprising a target
gene sequence operatively linked to an expression control
sequence
<130> 105170H
<160> 19
<170> PatentIn version 3.4
<210> 1
<211> 683
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> DNA
<400> 1
cttcgaattc tgcagtcgac ggtaccgcgg gcccgggatc cccccccccc cgacataaca 60
accagaatcc tcctctaaag aagcacctgg gagcacagct catcaccatg gactggacct 120
ggaggttcct ctttgtggtg gcagcagcta caggtgtcca gtcccaggtc cagctggtgc 180
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aatctggggc tgaggtgaag aagcctgggt cctcggtgaa gatctcctgc aaggcttctg 240
gaggcacctt cagcagctat actttcacct gggtgcgaca ggcccctgga caagggcttg 300
agtggatggg aaggatcatc cccaatgtcg gtatagcaaa ctacgcacag aagttccagg 360
gcagagtcac gcttatcgcg gacaaattca cgaattcaac gtacatggag ctgagcagcc 420
tgagatctga tgacacggcc gtttattttt gtgccggaga cccctcgggc cactcacatg 480
actactgggg ccaaggaacc ctggtcaccg tctcctcagc ttccaccaag ggcccatccg 540
tcttccccct ggcgccctgc tccaggagca cctccgagag cacagccgcc ctgggctgcc 600
tggtcaagga ctacttcccc gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca 660
gcggcgtgca caccttcccg gct 683
<210> 2
<211> 38
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> DNA
<400> 2
cttcgaattc tgcagtcgac ggtaccgcgg gcccggga 38
<210> 3
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> DNA
<400> 3
agccgggaag gtgtgcacgc cgctg 25
<210> 4
<211> 628
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> DNA
<400> 4
cttcgaattc tgcagtcgac ggtaccgcgg gcccgggatc caccggtcgc caccatggtg 60
agcaagggcg aggagctgtt caccggggtg gtgcccatcc tggtcgagct ggacggcgac 120
gtaaacggcc acaagttcag cgtgtccggc gagggcgagg gcgatgccac ctacggcaag 180
ctgaccctga agttcatctg caccaccggc aagctgcccg tgccctggcc caccctcgtg 240
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accaccctga cctacggcgt gcagtgcttc agccgctacc ccgaccacat gaagcagcac 300
gacttcttca agtccgccat gcccgaaggc tacgtccagg agcgcaccat cttcttcaag 360
gacgacggca actacaagac ccgcgccgag gtgaagttcg agggcgacac cctggtgaac 420
cgcatcgagc tgaagggcat cgacttcaag gaggacggca acatcctggg gcacaagctg 480
gagtacaact acaacagcca caacgtctat atcatggccg acaagcagaa gaacggcatc 540
aaggtgaact tcaagatccg ccacaacatc gaggacggca gcgtgcagct cgccgaccac 600
taccagcggc gtgcacacct tcccggct 628
<210> 5
<211> 3533
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220><223> DNA
<400> 5
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660
gatccccccc ccccccgata tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 720
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 780
tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 840
gctggtgaaa gtaaaagatg ctgaagatca gttgggtgca cgagtgggtt acatcgaact 900
ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 960
gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 1020
gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 1080
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agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 1140
gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 1200
cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 1260
gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 1320
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 1380
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 1440
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 1500
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 1560
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 1620
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 1680
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 1740
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 1800
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 1860
ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 1920
gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 1980
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 2040
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 2100
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 2160
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 2220
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 2280
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 2340
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 2400
tttacggttc ctggccgata tcacgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac 2460
cttcccggct gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc 2520
ctccagcagc ttgggcaccc agacctacac ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac 2580
caaggtggac aagagagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg 2640
cccagcacct gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga 2700
caccctcatg atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga 2760
agaccctgag gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac 2820
aaagccgcgg gaggagcagt acaacagcac gtaccgtgtg gtcagcgtcc tcaccgtcct 2880
gcaccaggac tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc 2940
공개특허 10-2013-0029460
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agcccccatc gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta 3000
caccctgccc ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt 3060
caaaggcttc tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa 3120
caactacaag accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa 3180
gctcaccgtg gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca 3240
tgagggtctg cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatgagt 3300
gcgacggcgg ccgcgactct agatcataat cagccatacc acatttgtag aggttttact 3360
tgctttaaaa aacctcccac acctccccct gaacctgaaa cataaaatga atgcaattgt 3420
tgttgttaac ttgtttattg cagcttataa tggttacaaa taaagcaata gcatcacaaa 3480
tttcacaaat aaagcatttt tttcactgca ttctagttgt ggtttgtcca aac 3533
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gggggggggg gggggggatc ccgg 24
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cgtggaactc aggcgccctg accag 25
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cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc ctacagtcct 60
caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg ggcacccaga 120
공개특허 10-2013-0029460
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cctacacctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag agagttgagc 180
ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa ctcctggggg 240
gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc tcccggaccc 300
ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc aagttcaact 360
ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag gagcagtaca 420
acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg ctgaatggca 480
aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag aaaaccatct 540
ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca tcccgggatg 600
agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat cccagcgaca 660
tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc acgcctcccg 720
tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac aagagcaggt 780
ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga gggtctgcac aaccactaca 840
cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aatgagtgcg acggcggcca agtcgacttg 900
gccgactcta gatcataatc agccatacca catttgtaga ggttttactt gctttaaaaa 960
acctcccaca cctccccctg aacctgaaac ataaaatgaa tgcaattgtt gttgttaact 1020
tgtttattgc agcttataat ggttacaaat aaagcaatag catcacaaat ttcacaaata 1080
aagcattttt ttcactgcat tctagttgtg gtttgtccaa actagttatt aatagtaatc 1140
aattacgggg tcattagttc atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt 1200
aaatggcccg cctggctgac cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta 1260
tgttcccata gtaacgccaa tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg agtatttacg 1320
gtaaactgcc cacttggcag tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga 1380
cgtcaatgac ggtaaatggc ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt 1440
tcctacttgg cagtacatct acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg 1500
gcagtacatc aatgggcgtg gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc 1560
cattgacgtc aatgggagtt tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg 1620
taacaactcc gccccattga cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat 1680
aagcagagct ggtttagtga accgtcagat ccgctagcgc taccggactc agatctcgag 1740
ctcaagcttc gaattctgca gtcgacggta ccgcgggccc gggatccccc ccccccc 1797
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공개특허 10-2013-0029460
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agagaagatc ttagttatta atagtaatca attacgg 37
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aaggaagatc tggacaaacc acaactagaa tgcagtg 37
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tagttattaa tagtaatcaa ttacgg 26
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tggacaaacc acaactagaa tgcagtg 27
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cggtaccgcg ggcccgggat cccccccccc cccdn 35
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acgctgctga gggagtagag tcctgag 27
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ctttggcctc tctgggatag aagtt 25
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acaacagagg cagttccaga tttcaactgc 30
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catcttcccg ccatctgatg agcag??????25
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tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
공개특허 10-2013-0029460
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cgttacataa cttacggtaa atggcccgcc tggctgaccg cccaacgacc cccgcccatt 120
gacgtcaata atgacgtatg ttcccatagt aacgccaata gggactttcc attgacgtca 180
atgggtggag tatttacggt aaactgccca cttggcagta catcaagtgt atcatatgcc 240
aagtacgccc cctattgacg tcaatgacgg taaatggccc gcctggcatt atgcccagta 300
catgacctta tgggactttc ctacttggca gtacatctac gtattagtca tcgctattac 360
catggtgatg cggttttggc agtacatcaa tgggcgtgga tagcggtttg actcacgggg 420
atttccaagt ctccacccca ttgacgtcaa tgggagtttg ttttggcacc aaaatcaacg 480
ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
acggtgggag gtctatataa gcagagctgg tttagtgaac cgtcagatcc gctagcgcta 600
ccggactcag atctcgagct caagcttcga attctgcagt cgacggtacc gcgggcccgg 660
gatccccccc ccccccgata tctaaataca ttcaaatatg tatccgctca tgagacaata 720
accctgataa atgcttcaat aatattgaaa aaggaagagt atgagtattc aacatttccg 780
tgtcgccctt attccctttt ttgcggcatt ttgccttcct gtttttgctc acccagaaac 840
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ggatctcaac agcggtaaga tccttgagag ttttcgcccc gaagaacgtt ttccaatgat 960
gagcactttt aaagttctgc tatgtggcgc ggtattatcc cgtattgacg ccgggcaaga 1020
gcaactcggt cgccgcatac actattctca gaatgacttg gttgagtact caccagtcac 1080
agaaaagcat cttacggatg gcatgacagt aagagaatta tgcagtgctg ccataaccat 1140
gagtgataac actgcggcca acttacttct gacaacgatc ggaggaccga aggagctaac 1200
cgcttttttg cacaacatgg gggatcatgt aactcgcctt gatcgttggg aaccggagct 1260
gaatgaagcc ataccaaacg acgagcgtga caccacgatg cctgtagcaa tggcaacaac 1320
gttgcgcaaa ctattaactg gcgaactact tactctagct tcccggcaac aattaataga 1380
ctggatggag gcggataaag ttgcaggacc acttctgcgc tcggcccttc cggctggctg 1440
gtttattgct gataaatctg gagccggtga gcgtgggtct cgcggtatca ttgcagcact 1500
ggggccagat ggtaagccct cccgtatcgt agttatctac acgacgggga gtcaggcaac 1560
tatggatgaa cgaaatagac agatcgctga gataggtgcc tcactgatta agcattggta 1620
actgtcagac caagtttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt 1680
taaaaggatc taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga 1740
gttttcgttc cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc 1800
tttttttctg cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt 1860
공개특허 10-2013-0029460
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ttgtttgccg gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc 1920
gcagatacca aatactgttc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc 1980
tgtagcaccg cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg 2040
cgataagtcg tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg 2100
gtcgggctga acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga 2160
actgagatac ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc 2220
ggacaggtat ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg 2280
gggaaacgcc tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg 2340
atttttgtga tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt 2400
tttacggttc ctggccgata tcacgtgcgc atcttcccgc catctgatga gcagttgaaa 2460
tctggaactg cctctgttgt gtgcctgctg aataacttct atcccagaga ggccaaagta 2520
cagtggaagg tggataacgc cctccaatcg ggtaactccc aggagagtgt cacagagcag 2580
gacagcaagg acagcaccta cagcctcagc agcaccctga cgctgagcaa agcagactac 2640
gagaaacaca aagtctacgc ctgcgaagtc acccatcagg gcctgagctc gcccgtcaca 2700
aagagcttca acaggggaga gtgttagagg gagaagtgcg gccaagtcga cttggccgac 2760
tctagatcat aatcagccat accacatttg tagaggtttt acttgcttta aaaaacctcc 2820
cacacctccc cctgaacctg aaacataaaa tgaatgcaat tgttgttgtt aacttgttta 2880
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catcttcccg ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct 60
gaataacttc tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc 120
gggtaactcc caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag 180
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공개특허 10-2013-0029460
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gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa 420
atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt attgcagctt ataatggtta caaataaagc 480
aatagcatca caaatttcac aaataaagca tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg 540
tccaaactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc ccatatatgg 600
agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc aacgaccccc 660
gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg actttccatt 720
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ggcccgggat cccccccccc cc 1222
공개특허 10-2013-0029460
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