공개특허 10-2004-0101889
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(19)대한민국특허청(KR)
(12) 공개특허공보(A)
(51) 。Int. Cl.7
C12N 9/42
C12N 15/56
C12N 9/26
C12N 9/24
(11) 공개번호
(43) 공개일자
10-2004-0101889
2004년12월03일
(21) 출원번호 10-2003-7009568
(22) 출원일자 2003년07월18일
번역문 제출일자 2003년07월18일
(86) 국제출원번호 PCT/IL2002/000044 (87) 국제공개번호 WO 2002/057408
(86) 국제출원출원일자 2002년01월17일 (87) 국제공개일자 2002년07월25일
(30) 우선권주장 60/261,834 2001년01월17일 미국(US)
(71) 출원인 라모트 앳 텔-아비브 유니버시티 리미티드
이스라엘 69975 텔-아비브 라마트-아비브 하임 레바논 스트리트 32
(72) 발명자 질버스테인,아비아
이스라엘 58910 홀론, 미베 이스라엘 애그리컬처럴 스쿨
아일렌버그,하비바
이스라엘 47203 라맷 하샤론, 하팔마치 스트리트 18
슈스터,실비아
이스라엘 43365 라나나, 하말롯 스트리트 18
(74) 대리인 황의만
심사청구 : 없음
(54) 식충성 식물 유래의 키티나제, 이를 암호화하는폴리뉴클레오타이드 서열 및 이의 분리방법 및 사용방
법
요약
본 발명은 식충성 식물의 조직이나 수프(soup)에서 분리된, 엔도키티나제 활성을 가진 것을 특징으로 하는 적어도 1
종의 단백질을 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.
색인어
키티나제, 식충성 식물, 엔도키티나제, 트랩 수프
명세서
기술분야
공개특허 10-2004-0101889
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본 발명은 식충성 식물 유래의 키티나제, 이 키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이 키티나제의 분리
방법 및 이 키티나제를 키틴 함유 병원균에 대한 식물의 감수성을 감소시키고 냉해와 서리 조건에 저항성인 식물을
제공하며 칸디다 알비칸스(Candida albians)와 같은 키틴 함유 병원균과 관련된 질병이나 증상을 앓고 있는 개체를
치료하는데 사용하는 방법에 관한 것이다.
배경기술
식물 병원균은 작물의 총 생산량에 영향을 미치고 종종 작물을 완전 파괴시킬 수 있다. 일정 세포 과정은 병원균 감염
에 저항성인 식물을 제공하고 관련 질병 증후가 발전되지 않도록 방지한다. 이러한 반응으로는 무엇보다도 병원균 관
련 단백질(PR 단백질)로 알려진 일군의 단백질류의 신합성이 있다. 하지만, 식물 병원균에 대한 보호를 위한 식물의
천연 산물의 사용에는 식물 방어 기작에 관련된 산물의 합성을 증가시키기 위한 기존 대사 경로의 향상을 수반한다.
이러한 대사 변조는 정상 성장, 동화물의 생산, 수확량 및 우량성을 발현하는 능력 등에 악영향을 미칠 수 있다. 결론
적으로, 이종원 유래의 보다 강력한 PR 단백질의 변이성 발현에 의한 식물 방어계의 변형은 매우 중대한 일이다(예컨
대, 유럽 특허 출원 0 392 225 참조).
가장 특징적인 PR 단백질 중 하나가 난균류(Oomycetes)를 제외하고는 대부분의 사상진균의 주요 세포벽 성분인 키
틴, 즉 N-아세틸-D-글루코사민(NAG)의 1,4 결합 중합체의 가수분해를 촉매하는 키티나제(E.C.3.2.2.14)이다. 이것
은 또한 절지동물, 선충류 및 연체동물의 중요한 성분이다. 진균류에서 키티나제는 성장 균사의 선단에서 키틴을 가
수분해하고 포자형성을 억제하며 기생근의 세포벽을 가수분해한다(Carr and Klessing, 1989). 이러한 가수분해 활
성은 진균의 성장 속도를 낮추고 식물 조직으로의 병원균의 침입을 지연시키거나 예방하는데 직접적인 역할을 한다.
키티나제는 또한 식물 방어 반응을 유인하는데 시그널 분자로서 작용하는 분해 산물을 진균 세포벽으로부터 방출시
키는데 간접적이지만 중요한 역할을 한다(Graham and Sticklen, 1994).
지금까지 분리된 대부분의 식물 키티나제는 핵심 키틴 구조인 작은 중합체를 방출시키는 엔도키티나제이다. 이 효소
의 분자량은 25 내지 40kDa 사이이고, 이 효소는 보통 최적 pH가 산성(pH 3 내지 6.5)인 단량체로서 활성을 띠고 보
조인자를 필요로 하지 않으며 넓은 온도 범위에서 안정하다. 키티나제는 많은 식물종에서 분리되었으며 이의 다중도
메인 구조에 따라 5가지 군(I군 내지 V군)으로 분류되고 있다(Collinge et al., 1993; Hamel et al., 1997).
제1군의 키티나제는 주로 염기성 단백질(pI 값이 염기성측인)로 구성되며 대 부분 액포를 표적으로 하며, 단자엽 식물
및 쌍자엽 식물 모두에서 발견된다. 이 효소는 높은 비활성을 나타내며 뿌리, 새순 및 꽃에서 나타나는 대부분의 식물
키틴분해 활성에 영향을 미친다(Legrand et al., 1987). 제1군의 키티나제는 5개의 구조 도메인, 즉 (i) 단백질을 소
포체로 유도하는 N-말단 시그널 펩타이드(20 내지 27개의 아미노산 잔기); (ii) 키틴 결합에 관여하고 고도 보존성 위
치에 8개의 시스테인 잔기를 포함하는 시스테인 고밀도 도메인(약 40개 아미노산의 CRD); (iii) 크기가 다양한 프롤
린(대부분 하이드록시프롤린) 고밀도 힌지(hinge) 영역(HR); (iv) 제II군 및 제IV군 키티나제의 촉매 도메인과 높은
상동성을 보이고 박테리아 키티나제의 CD와 낮은 상동성을 보이는 단백질의 중심 도메인을 포함하는 촉매성 도메인(
200개 미만의 아미노산인 CD); 및 (v) 이 키티나제 단백질을 액포로 유도하고 대부분의 제I군 키티나제에 존재하는
카르복시 말단의 연장부(CTE)로 이루어진다(Graham and Sticklen, 1994; Hamel et al., 1987). 병원균 침입에 대한
과민 반응시 생기는 세포 용해 동안 액포에 편재된 다량의 키티나제가 신속하게 방출된다. 또한, CTE가 없는 제I군의
몇 가지 염기성 키티나제는 특성이 규명되어 있다. 이러한 키티나제는 세포외 공간으로 분비된다(Legrand et al., 19
87; Swegle et al., 1992; Vad et al., 1991).
제II군의 키티나제는 시그널 펩타이드와 촉매성 도메인 만을 포함하는 산성 단백질(pI가 산성측임)이다. 이 촉매성 도
메인은 제I군 및 제IV군의 키티나제가 가진 촉매성 영역과 높은 아미노산 서열 상동성을 나타낸다. 이 산성 키티나제
의 비활성은 제I군의 키티나제의 비활성보다 낮다. 이것은 제II군 키티나제의 주요 기능 이 진균 병원균 세포벽의 부분
분해에 의해 방어 반응의 유도인자를 생성하는 것이기 때문인 것으로 생각된다(Graham and Sticklen, 1994).
제III군의 키티나제는 키티나제/라이소자임 활성을 가진 염기성 또는 산성의 세포외 단백질을 포함한다. 이의 촉매성
도메인은 제I군 및 제II군의 것과 상이하나 효소 및 사상형 진균 유래의 키티나제와는 유의적 동일성을 갖고 있다.
제IV군의 키티나제는 제I군의 키티나제와 구조 도메인의 유사성을 갖고 있으나 아미노산 서열 동일성은 높지 않다.
제IV군의 효소는 모두 CTE가 없고, 따라서 아포플라스트로 유도된다. 또한, 제I군의 단백질과 아미노산 서열 정렬시
4개의 독특한 결실을 보였는데, 1개는 키틴 결합 도메인에서, 3개는 촉매성 도메인에서 나타났다. 이 그룹에는 콩 유
래의 PR4 키티나제, 캐놀라(Canola) 유래의 ChB4 등이 있다(Hamel et al., 1997).
제V군의 키티나제는 박테리아, 예컨대 세라시아 마르센슨스(Serracia marcescens), 바실러스 서큘란스(Bacillus
circulans) 및 스트렙토마이세스 플리카투스(Streptomyces plicatus) 기원의 엑소키티나제와 약간의 상동성이 있
다.
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또한, 전술한 부류와 구조가 상이한 몇 가지 식물 키티나제도 특성이 밝혀져 있다. 몇 가지 산성 키티나제는 제I군의
구조적 조성을 가진 것으로 나타난다(Van Damme et al., 1993). 또 다른 특이 효소는 우르티카 디오이카(Urtica dioi
ca, UDA) 유래의 응집소형 키티나제로서, 제I군의 키티나제와 아미노산 서열 상동성이 있는 촉매성 도메인과 2개의
N-말단 키틴 결합 도메인을 포함한다. 하지만, 이 효소는 키틴 중합체를 절단하는 대신 침입한 진균 균사의 선단에
있는 키틴 사슬을 가교결합시켜 병원균의 성장을 억제하는 성질을 나타낸다(Lerner and Raikel, 1992). 엔도키티나
제 및 곤충의 알파-아밀라제 억제 활성이 모두 있는 동종이량체 완전효소가 율무(Croix lachrymosa) 종자에서 분
리되었다(Ary et al., 1989). 이와 같이, 키티나제 활성을 가진 특이 단백질이 다양한 식물계에서 발생되었다. 이러한
식물 키티나제에 관한 다량의 데이터에도 불구하고 지금까지 식충성 식물에서 분리된 키티나제는 보고된 바 없다.
중요한 작물의 병원균에 대한 식물 방어계는 광범위한 항진균 활성이 있는 단백질을 암호화하는 이종 유전자를 도입
시켜 변형시킬 수 있다. 단자엽 식물 중에서 돌연변이 식물을 제조하는 방법을 상세히 보고되어 있다. 성공적인 형질
전환 및 식물 재생 기법이 아스파라거스(Asparagus officinalis; Bytebier et al.(1987)); 보리(Hordeum vulgare; W
an and Lemaux(1994)); 옥수수(Zea mays; Rhodes et al.(1988); Gordon-Kamm et al.(1990); Fromm et al.(199
0); Koziel et al.(1993)); 귀리(Avena sativa; Somers et al.(1992)); 오처드그라스(Dactylis glomerata; Horn et al
.(1988)); 벼(Oryza indica 및 Oryza japonica 변종을 비롯한 Oryza sativa; Tornyama et al.(1988); Zhang et al.(1
988); Luo and Wu(1988); Christou et al.(1991)); 호밀(Secale cerale; De la Pena et al.(1987)); 사탕수수(Sorgh
um bicolor; Cassas et al.(1993)); 사탕수수(Saccharum spp.,; Bower and Birch(1992)); 톨페스큐(Festuca arund
inacea; Wang et al.(1992)); 투이프그라스(Agrostis palustris; Zhong et al.(1993)); 밀(Triticum aestivum; Vasil
et al.(1992); Troy Weeks et al.(1993); Becker et al.(1994))에서 이루어 진 바 있다.
세포벽 분해 효소, 특히 키티나제를 암호화하는 식물 유전자는 진균 병원균에 대한 식물 저항성을 향상시키는데 사용
된 바 있으나(예컨대, 미국 특허 제6,291,647호; 제6,280,722호; 각각 Melchers et al. 및 Moar), 어떤 단일 유전자
도 적당한 수준의 저항성을 나타내지는 못하였다(Broglie et al., 1991; Punja and Raharjo, 1996; Zhu et al., 1994;
Jach et al., 1995). 또한, 트리코데르마 하르지아넘(Trichoderma harzianum) 유래의 진균 키티나제가 담배, 감자(
Lorito et al., 1998) 및 사과(Bolar et al., 2000)에 대한 병원균에 효과적이라고 보고된 바 있지만, 항진균 유전자를
병입시킨 작물에 있어서 다중 병원균에 대한 지속적인 감수성은 일반적이며 희생이 큰 문제점으로 남아 있다. 최근에
돌연변이 진균 저항성 작물에 사용하기 위한 알파파 유래의 광범위 항진균 단백질이 리앙 등(Liang et al., 미국 특허
제6,329,504호)에 의해 개시되었지만 그 항진균 활성의 생화학적 특성은 밝혀진 바가 없다.
식물 병원균 저항성 단백질의 비활성은 질병 방어를 위한 유전자 및 그 산물의 선택에 있어서 고려해야 할 중요한 문
제이다. 즉, 비활성이 높은 새로운 식물 병원균 저항성 단백질을 얻는 것이 바람직할 것이다.
종래 기술에서는 식물 및 동물 질병의 치료 및 예방에 있어서 키티나제에 의한 키틴의 효소 분해를 이용한 다양한 용
도가 기술되어 있다. 예를 들어, 제인스 등(Jaynes et al)은 돌연변이 동물에 질병 저항성을 부여하기 위하여 비식물
성 항미생물 단백질의 용도, 특히 키티나제의 용도를 개시하였다(미국 특허 제6,303,568 호). 또한, 바실러스 투링젠
시스(B.thuringensis) 유래의 신규 키티나제가 모어(Moar)에 의해 보고되었다(미국 특허 제6,280,722호). 하지만, 식
충성 식물 유래의 키티나제에 대해서는 언급된 바 없다. 또한, 인간 병원균에 대하여 식물 키티나제를 적용하는 용도
에 대해서도 보고된 바는 없다.
식물에 유해성인 것 외에도, 진균, 원생동물 및 벌레(기생충)와 같은 키틴 함유 유기체는 또한 인간 및 동물에 대한 다
양한 감염성 질환의 원인 인자이다.
현재 이용가능한 제한된 수의 항진균 약물은 일반적으로 매우 강력하지 못하다. 진균 감염은 면역무능력자에게서 정
기적으로 나타나고, 가장 흔하게는 후천성 면역결핍증(AIDS) 환자에게서 나타난다. 피부에 일어나는 대부분의 진균
감염은 국소 제제로 치료된다. 내장 감염 및 표피 감염은 장기간의 전신 치료를 필요로 한다.
가장 흔한 진균 감염의 원인은 칸디다 알비칸스이다. 이 유기체는 구강 및 질 점막의 일반적인 공생 생물이지만, 심하
게 아픈 환자, 특정 면역결핍증을 앓고 있는 환자 및 국소 미생물 생태 교란시 광범위 항생제 투여를 받은 환자 중의
손상된 피부 상에서 병원체가 될 수 있다. 칸디다 감염의 극단적 결과는 폐렴, 심장내막염, 패혈증 및 심지어 사망에까
지 이를 수 있다. 유일한 효과적인 치료방법은 암포테리신 B의 정맥내 투여이다. 이 약물의 투여는 저혈압과 쇠약을
동반하는 심각한 부작용을 초래할 수 있다. 이러한 이유로 인해, 내성을 측정하기 위하여 초기 시험 용량을 주입한다.
플루사이토신(flucytosine)은 진균 세포로 들어가 DNA 및 RNA 합성을 방해하여 대사를 억제하는 합성 플루오르화
된 피리미딘이다. 이 화합물 은 일반적으로 전신 진균 감염을 치료하기 위하여 암포테리신 B와 함께 투여된다. 단독
으로 투여하는 경우에는 플루사이토신에 대한 저항성이 빠르게 형성된다.
인간에 대해서 심각한 감염성 질환을 일으킬 수 있는 다른 진균 종으로는 아스퍼질러스(Aspergillus), 크립토코커스(
Cryptococcus), 콕시디오이데스(Coccidioides), 파라콕시디오이데스(Paracoccidioides), 블라스토마이세스(Blasto
myces), 스포로트릭스(Sporothrix) 및 히스토플라스마 캡슐라텀(Histoplasma capsulatum)이 있다.
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따라서, 돌연변이 유기체에서 병원균에 대한 방어작용을 제공하기에 충분한 양으로 발현될 수 있는 신규 병원균 방어
성 화합물, 특히 식물 및 인간 병원성 진균에 대하여 효과적인 화합물을 동정하고 특성을 밝히는 일이 계속적으로 요
구되고 있다.
발명의 상세한 설명
발명의 개요
제1 양태에 따르면, 본 발명은 식충성 식물의 조직이나 수프(soup)에서 분리된, 엔도키티나제 활성을 가진 것을 특징
으로 하는 적어도 1종의 단백질을 포함하는 효소 조성물에 관한 것이다.
제2 양태에 따르면, 본 발명은 식충성 식물의 조직이나 수프의 단백질 추출물을 포함하고, 이 단백질 추출물이 엔도키
티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을 포함하는 것이 특징인 효소 조성물에 관한 것이다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 다른 특징에 따 르면, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이
하인 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII
폴리클론 항체와 반응성이 아닌 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 환원 조
건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 12% SD
S-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 12% SD
S-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 활성 성분으로서 상기 효소 조성
물과 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 항진균
활성을 나타내는 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 항진균 활성은 제균 활성인 것을
특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 항진균 활성은 항 칸디다 알비칸
스 활성인 것을 특징으로 한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 활성 성분으로서 상기 효소 조성
물과 담체 또는 희석제를 포함하는, 키틴 함유 병원균을 살균하기 위한 조성물이 제공된다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 활성 성분으로서 상기 효소 조성
물과 농경법적으로 허용성인 담체를 포함하는 농경용 조성물이 제공된다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성
값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분
석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호
6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로
한다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 적어도 1종의 단백질은 서열번호
5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분을 포함한다.
공개특허 10-2004-0101889
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하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조
직이다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 수프는 트랩 수프이다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nep
enthes sp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dionea sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성
된 군에서 선택되는 것이다.
하기 상세히 설명되는 본 발명의 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 엔도키티나제 활성을 갖고 있고,
갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신
서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서
열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 폴리펩
타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산이 제공된다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4 및 48이나
이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 폴리펩타이드는 서열번호 5, 6, 7 및 8이나 이의 활성 부분
으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서
열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및 합 성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 상기 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물이 제공된다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 상기 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포가 제공된다.
본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 엔도키티나제 활성을 갖고 있고 적어도 30개 아미노산의 시그널 펩타이드를 포함
하는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한 분리된 핵산이 제공된다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 시그널 펩타이드는 단백질 분비를 위한 것이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 48에 기재된
것 또는 이의 활성 부분이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 시그널 펩타이드는 서열번호 47에 기재된 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 갭 중량이 50이고, 길이 중량이 3이며, 평균 정합성이 10이고 평균 부정합성이 -9
인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFi
t) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 1과 67% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 2와 75% 이상 동일한 분
리된 핵산을 제공한다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 상기 폴리뉴클레 오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4 및 4
8 또는 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
본원에 기술된 바람직한 구체예의 또 다른 특징에 따르면, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서
열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및 합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 48에 기재된 분리된 핵산과 특이적으로 하이브리드할 수
있는 적어도 17개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 핵산 증폭 반응에서 일부분의 특이적 증폭을 유도하기 위해서 각각 반대 배향으로
서열번호 1, 2, 3, 4 또는 48과 특이적으로 하이브리드할 수 있는 적어도 17개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이
드 쌍을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드
앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트
공개특허 10-2004-0101889
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웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7
과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 분리된 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 서열번호 5, 6, 7 및 8 또는 이의 활성 부분으로 이루어진 군 중에서 선택되는 분리
된 폴리펩타이드를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 키틴 함유 병원균과 관련된 질환이나 증상이 있는 개체에게, 활성 성분으로서 식충
성 식물의 트랩 수프 또는 트랩 조직에서 유래하고 엔도키티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을 포함하는
단백질 추출물을 함유한 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법을 제
공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식충성 식물의 트랩 수프 또는 트랩 조직으로부터 엔도키티나제 활성을 나타내
는 단백질 분획을 추출하는 단계; 및 (b) 이 단백질 분획을 약학적 허용성 담체 또는 희석제와 혼합하여 키틴 함유 병
원균과 관련된 질환이나 증상을 치료하는데 유용한 약학적 조성물을 제조하는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드
앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트
웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7
과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 외인성 폴리펩타이드를 식물내에서 발현시키는 것을
포함하여, 키틴 함유 병원균에 대한 식물의 감수성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (a) 식충성 식물의 트랩 조직이나 트랩 수프로부터 단백질 추출물을 제조하는 단계;
및 (b) 이 단백질 추출물로부터 키티나제 활성 분획을 분리하여 높은 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를
분 리하는 단계를 포함하여, 높은 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 분리하는 방법을 제공한다.
또 다른 특징에 따르면, 이 방법은 추가로 단계 (a) 이전에 트랩 조직 또는 트랩 수프를 키틴에 노출시키는 것을 포함
한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 활성 성분으로서 식충성 식물의 수프 또는 조직에서 유래하고 엔도키티나제 활성
을 나타내는 적어도 1종의 단백질을 포함하는 단백질 추출물을 함유한 조성물에 복수의 식물을 노출시키는 것을 포
함하여, 냉해에 대한 식물의 감수성을 감소시키는 방법을 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드
앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트
웨어를 사용하여 측정했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7
과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 폴리뉴클
레오타이드 서열을 포함하는 식물, 식물 조직 또는 식물 종자를 제공한다.
또 다른 양태에 따르면, 본 발명은 엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 프롤린 아미노산이 10개 이상 내지 15개 이하인
프롤린 고밀도 영역을 포함하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한 분리된 핵산을 제공한다.
본원에 기술된 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 상기 프롤린 고밀도 영역은 6개의 추정상의 글리코
실화 부위를 포함한다.
본원에 기술된 바람직한 구체예에 속하는 또 다른 특징에 따르면, 상기 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는
48에 기재된 것이거나 이의 활성 부분이다.
본 발명은 식충성 식물 유래의 신규 키티나제, 이 키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열 및 이 키티나제의
분리방법 및 이 키티나제를 키틴 함유 병원균에 대한 식물의 감수성을 감소시키고 냉해와 서리 조건에 저항성인 식물
을 제공하며 칸디다 알비칸스(Candida albians)와 같은 키틴 함유 병원균과 관련된 질병이나 증상을 앓고 있는 개체
를 치료하는데 사용하는 방법을 제공함으로써 현재 공지된 구성의 단점을 성공적으로 해결하고 있다.
도면의 간단한 설명
본 발명은 본원에서 첨부되는 도면을 참조로 하여 단지 예시적으로 설명되고 있다. 이하 상세한 도면에 대한 구체적
설명과 함께 제시된 세부사항은 예시적이며 단지 본 발명의 바람직한 구체예를 실례로서 논의하기 위한 것이고 제시
된 근거는 본 발명의 원리와 개념적 양태를 가장 유용하고 쉽게 이해할 수 있는 설명인 것으로 간주되기 때문임을 명
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백히 하는 바이다. 이와 관련하여 본 발명의 기본적 이해에 필요한 것 보다 더 상세하게 본 발명의 구조적 세부사항을
나타내고자 하지 않았으며 도면과 함께 제시된 설명은 본 발명의 여러 가지 형태가 어떻게 실제로 구현될 수 있는지
를 당업자에게 명백히 하기 위한 것이다.
도면에서,
도 1은 네펜테스(Nepenthes) 트랩 수프에서 관찰되는 신규 키티나제 활성의 존재를 입증하는 키티나제 활성 겔을
제시한 것이다. 잎, 개방 트랩 조직 추출물, 폐쇄 트랩 조직 추출물(150㎕) 및 트랩 수프(75㎕) 시료를 15% 천연 PAG
E 상에서 분리하였다. 전기영동 후, 이 겔을 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을 함유하는 제2 겔과 중층시키고, 37℃에서 하
룻밤 동안 항온처리한 뒤 0.01% 칼코플루오르(Calcofluor) 백색 M2R로 5분 동안 염색하였다. 키티나제 활성(용해
활성의 어두운 염색 밴드)은 UV 조명으로 가시화하였다. 다른 식물 조직의 키티나제 활성과 다르게 이동하는 트랩 수
프에서 관찰된 새로운 키티나제 활성 밴드의 존재가 주목된다.
도 2a 및 도 2b는 신규 트랩 수프 키티나제와 S.마르세슨스(S.marcescens) 키티나제 사이의 항원 유사성이 없음을
입증하는 웨스턴 블롯이다. 네펜테스 유래의 조직 추출물(잎=L; 트랩 조직=C) 및 트랩 수프(S)와 S.마르세슨스 추출
물(Ser)을 함유하는 대장균 추출물을 15% SDS-PAGE 상에서 분리하고, PVDF 막 상에 블롯팅한 뒤 S.마르세슨스 C
hiAII 키티나제를 인식하는 토끼 폴리클론 항체로 탐침하였다. 면역반응성 밴드는 알칼리성 포스파타제가 접합된 염
소 항 토끼 항체의 결합을 통해 가시화하였다. 도 2a - 잎(L) 추출물 및 트랩 조직(C) 추출물 50㎕, 트랩 수프(S) 40㎕
및 S.마르세슨스 ChiAII 키티나제(Ser)를 과잉발현하는 대장균 세포 100ng 추출물을 각각 함유하는 시료. 도 2b -
잎(L) 추출물 50㎕, S.마르세슨스 ChiAII 키티나제(Ser)를 과잉발현하는 대장균 세포 100ng 및 농축 트랩 수프(S) 8
75㎕를 각각 함유하는 시료. 화살표는 면역반응성 잎 추출물과 대장균 밴드를 표시하는 반면, 심지어 22배 농도의 트
랩 수프는 S.마르세슨스에 대한 항체와의 항원성 교차반응을 전혀 나타내지 않았다.
도 3은 SDS 변성에 대한 네펜테스 트랩 수프내의 신규 키티나제 활성의 저항성을 입증하는 반변성 키티나제 활성 겔
을 제시한 것이다. 일정량의 잎(L) 및 트랩 조직(C) 추출물(150㎕), 트랩 수프(S) (75㎕) 및 S.마르세슨스 ChiAII 키티
나제(Ser)를 과잉발현하는 대장균 세포 0.6㎍ 추출물을 비등하지 않거나 2-머캅토에탄올을 첨가하지 않은 15% SDS
-PAGE 상에서 분리하였다. 전기영동 후, 이 겔을 40mM 트리스-HCl, pH 8.8, 1% 카세인, 2mM EDTA 중에서 항온
처리하여 복원시킨 뒤 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을 함유하는 제2 겔과 중층시키고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한
뒤 0.01% 칼코플루오르 백색 M2R로 5분 동안 염색하였다. 키티나제 활성(용해 활성의 어두운 염색 밴드)은 UV 조
명으로 가시화하였다. 일정하게 더 느리게 이동하는 신규 트랩 수프의 키티나제 활성 밴드(S)가 관찰되었다.
도 4a 및 도 4b는 SDS 및 2-머캅토에탄올 변성에 대한 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제 활성의 감수성을 입증하는
변성 키티나제 활성 겔을 제시한 것이다. 일정량의 잎(L) 추출물(150㎕), 트랩 수프(S) (75㎕) 및 S.마르세슨스 ChiAI
I 키티나제(Ser)를 과잉발현하는 대장균 세포 0.6㎍ 추출물을 비등하지 않거나(도 4a) 또는 5분 동안 비등한(도 4b) S
DS와 2-머캅토에탄올에 준비하고, 15% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 전기영동 후, 이 겔을 40mM 트리스-HCl,
pH 8.8, 1% 카세인, 2mM EDTA 중에서 항온처리하여 복원시킨 뒤 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을 함유하는 제2 겔과
중층시키고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한 뒤 0.01% 칼코플루오르 백색 M2R로 5분 동안 염색하였다. 키티나제
활성(용해 활성의 어두운 염색 밴드)은 UV 조명으로 가시화하였다. 비등 여부에 관계없이 변성 후 다른 키티나제와
달리 신규 트 랩 수프 키티나제 활성 밴드(S)가 사라지는 것이 관찰되었다.
도 5는 높은 비활성의 네펜테스 트랩 수프 키티나제를 입증하는 쿠마시 블루 염색된 SDS PAGE이다. 농축된 트랩 수
프(S)(600㎕), 58kDa S.마르세슨스 ChiAII 키티나제(Ser)를 과잉발현하는 대장균의 단백질 추출물 4㎍ 및 크기 마커
(SM)의 각 시료를 15% SDS PAGE 상에서 분리하고 쿠마시 블루 염색으로 가시화하였다. 트랩 수프에서는 단백질의
검출가능한 양이 관찰되지 않았다.
도 6은 네펜테스 트랩 수프 효소의 정제와 농도를 FPLC로 예시한 것이다. 트랩 수프를 탈염시키고 세파덱스(Sephad
ex) G-25 상에서 겔 여과하여 pH 10으로 조종한 뒤, 모노 Q 음이온 교환 컬럼 상에 장입하고, NaCl 농도를 증가시
키면서 결합된 키티나제를 용출시켰다. 키티나제 활성은 이하 '방법' 문항에 기술된 바와 같이 키티나제 활성 겔 상에
서 측정하고, 단백질 농도는 280nm에서의 흡광도에 따라 평가하였다. 수직 화살표는 키티나제 활성을 나타내는 분획
을 표시한 것이다.
도 7은 폐쇄된 네펜테스 트랩 수프의 FPLC 분획에서 관찰되는 키티나제 활성의 정제를 입증한 SDS-PAGE 분리 결
과이다. 트랩 수프를 음이온 교환 컬럼 상에 장입하고, 도 6에 기술한 바와 같이 NaCl 구배(0 내지 600mM) 하에 결
합된 단백질을 용출시켰다. 그 다음, 각 분획(레인 5 내지 20)을 활성 겔 상에서 키티나제 활성에 대해 시험하였다. 키
티나제 활성은 로 표시하였다. 각 분획의 단백질 함량은 SDS-PAGE 및 은 염색으로 분석하였다. '푸울' 레인에는
키티나제 활성을 나타내는 수집 농축(8배)된 FPLC 정제 분획 50㎕를 장입시켰다. SM은 크기 마커이다.
도 8은 키틴 주입에 의해 복수 형태의 네펜테스 트랩 수프 키티나제가 유도 됨을 입증하는 키티나제 활성 겔이다. 폐
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쇄된 트랩 내에 콜로이드성 키틴(pH 5.0) 약 1mg을 주입하였다. 비유도 수프(주입 전)(레인 3, 30㎕), 유도 후 20시
간(레인 4, 30㎕) 및 5일(레인 5, 30㎕) 경과된 트랩 수프, 농축된(8배) FPLC 정제된 비유도 수프 키티나제(레인 2, 1
5㎕) 및 세라티아 ChiAII를 과잉발현하는 대장균 세포 0.6㎍ 추출물(레인 1)을 각각 함유하는 시료를 천연 15% PAG
E 겔 상에서 분리하였다. 전기영동 후 겔을 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을 함유하는 제2 겔과 중층시키고 키티나제 활성
을 분석하였다. 유도성 키티나제 활성 밴드가 추가로 존재하는 것이 관찰되었다(레인 4 및 5).
도 9는 키틴 유도된 단백질 밴드를 입증하는 네펜테스 트랩 수프의 SDS-PAGE 분리 및 은 염색 결과이다. 폐쇄된 트
랩 내에 콜로이드성 키틴(pH 5.0) 약 1mg을 주입하였다. 비유도 트랩 수프(레인 1, 100㎕), 유도 후 4일(레인 2), 8일
(레인 3) 및 14일(레인 4)된 트랩 수프 100㎕, 또는 농축된(8배) FPLC 정제된 비유도 수집된 수프(레인 5, 50㎕)를
각각 함유하는 시료를 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 단백질 밴드의 이동은 은 염색으로 가시화하였다. 적
어도 4개의 추가 키틴 유도성 단백질 밴드가 관찰되었다(레인 2, 3 및 4).
도 10a 내지 10c는 식물 및 인간 병원균에 대한 키틴 유도 네펜테스 트랩 수프 키티나제의 제균 활성을 예시하는 성
장 억제 분석 평판을 제시한 것이다. 도 10a에서 인간 병원균 칸디다 알비칸스를 억제하는 최소 억제 농도(MIC) 값을
이하 '방법' 문항에 상세히 기술된 바와 같이 배양액에서 측정하였다. 또한 효모 치사율(최소 제균 농도, MFC) 측정은
트랩 수프를 첨가하지 않은 고체 배지(Sabuaruad) 상에 트랩 수프에 노출시킨 세포 100㎖를 재도말하고 28℃에서 4
8시간 동안 항온처리한 후 콜로니 수를 계수하여 실시하였다. 1:8 희석율(우측 평판)의 트랩 수프에 비해 1:4 희석율(
좌측 평판)의 트랩 수프에 노출된 C.알비칸스 콜로니가 거의 완전히 사라진 것을 관찰할 수 있었다. 도 10b는 식물 병
원균 셉토리아 트리티시(Septoria tritici)에 대해 나타나는 키틴 유도된 네펜테스 트랩 수프 키티나제의 제균 활성을
예시한 것이다. 셉토리아 트리티시 분생자기(2.5x10 4 분생자기/ml, 100㎕)의 액체 배양물을 증가되는 희석율(1-1/
32)의 네펜테스 키틴 유도된 트랩 수프 100㎕(비희석된 시료의 총 단백질 농도 = 3.1㎎/ml)와 함께 19℃에서 6일 동
안 항온처리하였다. OD 550하에 분광광도계로 측정한 결과 최소 억제 희석율은 1:2였다. 시료(50㎕)를 트랩 수프가
첨가되지 않은 맥아 고체 배지에 도말하고 추가 6일 동안 동일한 조건하에 항온배양하였다. 각 시료 옆에 희석율을 표
시하였다(1, 1/2, 1/16, 1/32). 대조 배양물은 트랩 수프(H 2 O) 없이 항온배양하였다. 희석되지 않은 트랩 수프(1)에
노출 시 생존하는 S.트리티시 분생자기는 없었다. 도 10c는 라이족토니아 솔라니(Rhizoctonia solani) 및 아스퍼질륨
종 균사 성장에 대해 키틴 유도된 네펜테스 트랩 수프 키티나제가 나타내는 제균 활성을 예시한 것이다. 라이족토니
아 또는 아스퍼질러스의 대수기 배양물을 함유하는 평판에 5배 농축된 트랩 수프 시료(20㎕)를 주입하였다. 트랩 수
프 키티나제가 주입된 부위(화살표) 근처에서 억제 영역이 관찰되었다.
도 11은 네펜테스 트랩 수프 염기성 키티나제 1 유전자 Nkchit1b(서열번호 1)의 전체 뉴클레오타이드 서열이다. 인
트론은 녹색으로, 제1 메티오닌과 종결 코돈은 적색으로 표시하였다.
도 12a 및 도 12b는 네펜테스 트랩 수프 염기성 키티나제 2 유전자 Nkchit2b의 핵산 및 추론된 아미노산 서열을 예
시한 것이다. 도 12a는 네펜테스 키티나제 2 cDNA의 추론된 아미노산 서열을 비교한 것이다. cDNA는 트랩 분비 조
직으로부터 분리된 mRNA를 가지고 RT-PCR 전략을 통해 합성하였다. 키티나제 2 유전자 특이적 프라이머를 사용
하여 몇 가지 키티나제 2 PCR 클론을 분리하였다. 2종의 cDNA 서열, Nkchit2b-II(서열번호 3) 및 Nkchit2b-III(서
열번호 4)이 동정되었다. 6개 아미노산 부정합 중에서 녹색으로 표시한 부분은 게놈 클론에 의해 암호화된 본래 Nkc
hit2b와 동일한 것으로서, 역 PCR로 분리하였다. 도 12b는 네펜테스 트랩 수프 염기성 키티나제 2 유전자 Nkchit2b
의 전체 뉴클레오타이드 서열(서열번호 2)이다. 인트론은 녹색으로, 제1 메티오닌과 종결 코돈은 적색으로 표시하였
다.
도 13은 데이터베이스에서 염기성 키티나제의 구조에 따라 추론된 NkCHIT1b(ch1)(서열번호 5) 및 NkCHIT2b(ch2
)(서열번호 6)의 아미노산 서열 정렬(PRETTYBOX) 및 기능성 도메인을 예시한 것이다. 기능성 도메인은 색으로 표
시하였다: 시그널 펩타이드 - 녹색, 시스테인 고밀도 도메인 - 오렌지색, 초가변 프롤린 고밀도 영역 - 연청색, 촉매
도메인 - 적색 및 C-말단 연장부 - 자주색.
도 14는 NkCHIT1b(서열번호 5)와 상동성이 가장 높은 공지된 단자엽 및 쌍자엽 키티나제의 아미노산 서열을 복수
서열 정렬한 것이다. 공지의 키티나제는 이들의 NCBI 수탁 번호로 표시하였다: s40414 - 오라이자 사티바 1; s3997
9 - 오라이자 사티바 2; x56063 - 오라이자 사티바 3; 오라이자 - 오라이자 사티바 4(383024); t03614 - 오라이자
사티바 5; jc2071 - 세칼르 시리얼 1; 세칼르 - 세칼르 시리얼 2(741317); s38670 - 트리티컴 애스티범; af000966
- 포아 프라텐시스; 137289 - 오라이자 사티바 6; z78202 - 퍼세아 아메리카나; p51613 - 비티스 비니페라; 및 ch
1 - NkCHIT1b. NkCHIT1b에서 추론된 글리코실화 부위는 바이올렛색 점으로 표시하였다. 기능적으로 유의적인 공
통된 각 아미노산은 색으로 표시하였다: 시스테인(황색) - 이황화 가교에 관여; 트레오닌 및 글루타민(적색) - 활성
부위 기하형태 유지; 글루탐산 및 아스파라긴(녹색) - 촉매작용에 중요; 타이로신(청색) - 촉매 틈에 대한 기질 결합
에 중요.
도 15는 NkCHIT2b(서열번호 6)과 상동성이 가장 높은 공지된 단자엽 및 쌍자엽 키티나제의 아미노산 서열을 복수
서열 정렬한 것이다. 공지의 키티나제는 이들의 NCBI 수탁 번호로 표시하였다: y10373 - 메디카고 트룬카툴라; t09
687 - 메디카고 사티바; p21226 - 피섬 사티범; aj012821 - 시서 아리티넘; p06215 - 파세올러스 불가리스 1; p36
공개특허 10-2004-0101889
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361 - 파세올러스 불가리스 2; s57482 - 비그나 운귀큘라타; 콩 - 소포카르푸스 테트라고놀로부스 (BAB13369); x
56063 - 오라이자 사티바 1; 오라이자 - 오라이자 사티바 2(383024); t03614 - 오라이자 사티바 3; ch2 - NkCHIT
2b; p51613 - 비티스 비니페라; 및 z78202 - 퍼세아 아메리카나. NkCHIT2b와 상동성이 큰 다른 모든 키티나제와
비교했을 때 NkCHIT2b에 고유한 2개의 아미노산, 발린과 글루탐산은 각각 갈색과 흑색 화살표로 표시하였다. NkC
HIT2b에서 추론된 글리코실화 부위는 자주색 점으로 표시하였다. 기능적으로 유의적인 공통된 각 아미노산은 색으로
표시하였다: 시스테인(황색) - 이황화 가교에 관여; 트레오닌 및 글루타민(적색) - 활성 부위 기하형태 유지; 글루탐
산 및 아스파라긴(녹색) - 촉매작용에 중요; 타이로신(청색) - 촉매 틈에 대한 기질 결합에 중요.
도 16a 및 도 16b는 NkCHIT2b에서 보존된 아미노산을 예시한 것이다. 도 16a는 NkCHIT2b와 상동성이 큰 유전자
뱅크에서 입수한 단자엽 및 쌍자엽 키티나제의 아미노산 서열과 NkCHIT2b의 복수 서열 정렬된 단편이다. 비교 및 3
차원 구조 예측을 위해 보리(Hordeum vulgare L., p23951) 엔도키티나제의 아미노산 서열 분절을 포함시켰다. 키티
나제 기능에 관련이 있는 아미노산은 화살표로 표시하였다. 도 16b는 분자의 우측과 좌측에서 본 NkCHIT2b의 3차
원 구조 모델(SWISS-MODEL Protein Modeling, http://www.expasy.ch/swissmod/SWISS-MODEL)을 예시한 것
이다. 키티나제 기능에 관련된 각 아미노산은 밝게 강조하였다. 촉매 틈 내의 아미노산 Glu 134, Glu 156, Asn 191
및 Phe 190의 위치가 주목된다.
도 17은 신규 네펜테스 트랩 수프 염기성 키티나제 NkCHIT1b의 아미노산 서열내 가능한 O-글리코실화 부위를 예
측한 결과이다. 예측은 해독후 변형을 예측하는 ExPaSy 몰리큘라 서버(NetOGlyc prediction, http://www.cbs.dtu.
dk/services/NetOGlyc)로 실시하였다. NkCHIT1b가 프롤린 고밀도 힌지 영역에 집중된 9개의 가능한 글리코실화
부위를 갖고 있음이 주목된다.
도 18은 신규 네펜테스 트랩 수프 염기성 키티나제 NkCHIT2b의 아미노산 서열내 가능한 O-글리코실화 부위를 예
측한 결과이다. 예측은 해독후 변형을 예측하는 ExPaSy 몰리큘라 서버(NetOGlyc prediction, http://www.cbs.dtu.
dk/services/NetOGlyc)로 실시하였다. NkCHIT2b가 단지 1개의 가능한 글리코실화 부위를 갖고 있음이 주목된다.
도 19는 신규 키티나제의 차등 발현을 예시하는 비유도 네펜테스 트랩 조직 유래의 mRNA의 RT-PCR 분석 결과를
도시한 것이다. 고온 붕산염/단백분해효소 K 방법으로 폐쇄 트랩으로부터 분리한 mRNA를 올리고 dT 프라이머와 함
께 사용하여 cDNA를 합성하였다. 연속 PCR 증폭에는 표시한 특정 프라이머를 사용하였다. 각각의 유전자 특이적 P
CR 반응에는 역전사효소를 첨가하지 않은 대조 반응(-RT)을 함께 실시하였다. 또한, 양성 대조용으로는 주형으로서
게놈 DNA를 사용한 반응을 실시하였다. PCR 산물은 아크릴아마이드 겔 전기영동으로 분리하고, EtBr으로 염색한
뒤 UV 조명하에 가시화하였다. 시료로는 특정 Nkchit1b 프라이머(레인 1 = RT, 레인 2 = -RT 대조군) 및 주형으
로서 게놈 Nkchit1b DNA(레인 3)를 사용하여 얻은 RT-PCR 산물; 특정 Nkchit2b 프라이머(레인 4 = RT, 레인 5=
-RT 대조군), 주형으로서 게놈 Nkchit2b DNA(레인 6), 5' 및 3' 대조용 프라이머(각각 레인 7 및 8)를 사용하여 얻은
RT-PCR 산물; 특정 산성 키티나제 프라이머(레인 9 = RT, 레인 10 = -RT 대조군) 및 주형으로서 게놈 산성 키티
나제 DNA(레인 11)를 사용하여 얻은 RT-PCR 산물; 염기성 키티나제 변성 프라이머 Bs2(레인 12 = RT, 레인 13
= -RT 대조군) 및 주형으로서 게놈 염기성 키티나제 DNA(레인 14)를 사용하여 얻은 RT-PCR 산물; 및 염기성 키티
나제 변성 프라이머 Bs1(레인 15 = RT, 레인 16 = -RT 대조군) 및 주형으로서 게놈 Bs1 DNA(레인 17)를 사용하
여 얻은 RT-PCR 산물을 사용하였다. Nkchit1b가 Nkchit1b(레인 1) 프라이머 및 산성 키티나제(레인 9) 프라 이머와
단지 매우 희미한 특이적 밴드를 생성하는 반면 Nkchit2b 프라이머(레인 4)와는 강한 특이적 밴드를 생성하는 것이
주목된다. 또한, 주형으로서 게놈 DNA가 사용되었을 때(예컨대, 레인 3 및 6) 보다 고분자량의 산물이 생성된다는 것
이 주목된다. 또한, 고분자량 마커 및 저분자량 마커(SM)도 포함시켰다.
도 20은 신규 키티나제의 특이적 유도를 예시하는 키틴 유도된 네펜테스 트랩 조직 유래의 mRNA의 RT-PCR 분석
결과를 도시한 것이다. mRNA는 키틴 주입 유도 후 4일째 트랩 조직으로부터 분리하였다. mRNA 분리, cDNA 합성,
RT-PCR, 산물의 분리 및 가시화, 및 특정 프라이머들의 동일성은 도 19에 기술된 바와 같이 실시하였다. 유도된 트
랩(레인 1) 유래의 mRNA에서 나타나는 Nkchit1b 전사체의 유의적인 증가 및 추가 키티나제 산물이 그룹 2 축퇴성
프라이머를 사용하여 유도된 트랩에서 나타나는 것이 주목된다(레인 12).
도 21은 플라스미드 pPCV702-chit1/chit2-HA의 물리적 지도이다. 이 플라스미드는 HA 펩타이드 태그 서열에 해
독적으로 융합되고 직렬된 구성형 CaMV 35S 프로모터에 의해 가동되는 Nkchit1b-I 또는 Nkchit2b-II 유전자를 보
유한 아그로박테리움 셔틀 벡터이다. nptII 선택성 마커의 존재가 주목된다. 플라스미드 크기는 12.33kb이다.
도 22는 돌연변이 댐배 식물내 Nkchit1b-gI-HA 융합 단백질의 발현 및 정확한 가공을 입증하는 웨스턴 블롯이다.
이하 '실시예' 문한에 기술된 바와 같이 pPCV702-chit1-HA를 이용한 담배 잎반의 아그로박테리움 매개 형질전환으
로 생성되어진 6개의 돌연변이 식물(레인 1 내지 6), 야생형 식물(음성 대조군, 레인 NN) 및 돌연변이 세라티아 키티
나제-HA 발현 식물(양성 대조군, 레인 7)에서 각각 유래한 잎 조직 추출물(0.5g)을 이하 '방법' 문항에 상세히 기술된
바와 같이 제조하고, 12% SDS-PAGE 겔 상에서 분리하였다. 단백질을 PVDF 막 상에 블롯팅하고, 융합 단백질은 폴
리클론 래트 항-HA 항체를 사용하여 탐침하고 알칼리성 포스파타제가 접합된 친화성 정제된 염소 항래트 IgG(흑색
밴드)로 가시화하여 검출하였다. 신규 네펜테스 키티나제 융합 단백질의 다양한 발현 정도를 나타내는 36kDa 밴드의
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존재 및 59kDa 세라티아 키티나제-HA 융합 단백질의 양성 존재(레인 7)가 주목된다.
도 23은 돌연변이 담배 식물에서의 Nkchit2b-gII-HA 융합 단백질의 발현 및 정확한 가공을 입증하는 웨스턴 블롯이
다. 이하 실시예 문항에 기술된 바와 같이 pPCV702-chit2-HA로 아그로박테리움 매개 형질전환시킨 담배 잎반에서
생성되어진 5가지 돌연변이 식물(레인 1 내지 5)과, 야생형 식물(음성 대조군, 레인 NN) 및 돌연변이 세라티아 키티
나제-HA 발현 식물(양성 대조군, 레인 6)로부터 잎 조직(0.5g) 추출물을 각각 제조하고 상기 도 22에 기술된 바와 같
이 분리하였다. 단백질의 블롯팅과 검출은 도 22에 설명한 바와 같이 실시하였다. 신규 네펜테스 키티나제 융합 단백
질의 다양한 발현 정도(화살표, 레인 2 및 4)와 59kDa 세라티아 키티나제-HA 융합 단백질의 양성 결과(레인 6)를 나
타내는 32.7kDa 밴드의 존재가 주목된다.
도 24는 식충성 식물 디오네아(Dionea), 사라세니아(Sarracenia) 및 드로세라(Drosera)의 트랩에서 관찰되는
복수 형태의 신규 키티나제 활성을 예시한 천연 키티나제 활성 겔을 나타낸 것이다. 트랩 조직 추출물은 식충성 식물
디오네아, 사 라세니아 및 드로세라를 각각 갓 측정한 중량 1g 당 1.4ml, 1.6ml 또는 1.9ml 추출 완충액(0.125M 트리
스-HCl, pH 7.0 및 20% 글리세롤) 중에서 파쇄하여 제조하였다. 트랩 조직 추출물(60㎕-레인 1, 100㎕-레인 2 및 1
40㎕-레인 3)과 세라티아 ChiA II를 과잉발현하는 대장균 0.6㎍ 추출물(레인 4)을 천연 15% PAGE 상에서 분리하고
, 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을 함유하는 키티나제 활성 겔과 중층시키고, 37℃에서 하룻밤 동안 항온처리한 뒤 0.01%(
w/v) 칼코플루오르 백색 M2R로 5분 동안 염색하였다. 키티나제 활성은 UV 조명(320nm)으로 검출하였다(용해 활성
의 어두운 밴드). 총 3가지 식충성 식물에서 얻어진 트랩 조직 추출물(모든 겔에서 레인 1,2 및 3)에서 관찰되는 복수
형태의 유의적 키티나제 활성의 존재가 주목된다.
도 25는 드로세라(서열번호 7) 및 디오네아(서열번호 8) 키티나제 유전자 및 상동성인 식물 키티나제 유전자 뱅크 서
열의 추론된 부분 아미노산 서열을 복수 서열 정렬한 것이다. 여기에는 추론된 네펜테스 키티나제 아미노산 서열 2개
(각각 Nkchit1b 및 Nkchit2b를 나타내는 ch1 및 ch2)가 포함된다. 공지 키티나제 서열의 NCBI 수탁 번호는 다음과
같다: 알리움-알리움 사티범(M94105); 감자-솔라넘 튜베로섬(X67693); 메디카고-메디카고 트루카툴라(Y10373);
및 피섬-피섬 사티범(L37876). 광범위한 상동성 영역이 주목된다.
도 26a 및 도 26b는 세라티아 마르세슨스 키티나제 및 네펜테스 트랩 수프 키티나제 단백질을 정량 평가한 것이다.
표시된 단백질은 겔 전기영동으로 분리하고 은 염색하여 가시화하였다. 도 26a는 제시된 용량의 시중에서 입수용이
한 세라티아 마르세슨스(58kDa) 및 특정 양의 소혈청 알부민(BSA, 66kDa)을 나타낸다. 도 26b는 제시된 용량의 네
펜테스 트랩 수프 키티나제 및 특정 양의 탄산탈수효소(29kDa)를 나타낸다. SM은 분자량 마커를 나타낸다.
도 27a 및 도 27b는 세라티아 마르세슨스 및 네펜테스 트랩 수프 키티나제로 실시한 키티나제 활성 분석의 결과이다.
키티나제 활성은 시판되는 세라티아 마르세슨스 키티나제(도 27a) 100ng 및 트랩 수프 키티나제(도 27b) 20 내지 3
0ng을 가지고 측정하였다. 기질로서 사량체 p-니트로페닐-β-D-N-N'-N'-트리아세틸키토트리오스를 사용하고 p-
니트로페닐 방출률을 측정하였다.
바람직한 구체예의 상세한 설명
본 발명은 식충성 식물 유래의 키티나제 및 키티나제 함유 조성물, 이 키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서
열 및 이 키티나제를 분리하는 방법 및 이 키티나제 및 키티나제 조성물을 키틴 함유 병원균에 대한 식물의 감수성을
감소시키고 냉해와 서리 조건에 저항성인 식물을 제공하며 칸디다 알비칸스(Candida albians)와 같은 키틴 함유 병
원균과 관련된 질병이나 증상을 앓고 있는 개체를 치료하는데 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 원리 및 작동은 이하 상세한 설명과 도면을 참조로 하여 더 잘 이해될 수 있다.
본 발명의 1 이상의 구체예를 상세히 설명하기에 앞서, 본 발명이 본 출원에서 이하 상세한 설명에 기재되거나 이하
실시예 문항에 기술된 도면에 설명된 세부 구성 및 성분의 배열에 한정되지 않음은 자명한 것이다. 본 발명은 다른 구
체예로 이루어지거나 다양한 방식으로 실시 또는 수행될 수 있다. 또한, 본 명세서에 사용 된 구절 및 용어는 설명하기
위한 것으로서 제한적인 의미로 간주되어서는 안됨을 명심해야 한다.
식물은 토양 진균 및 선충류를 비롯한 다양한 병원균에 의해 유발되는 질병에 민감한 경우가 종종 있다. 이 질병은 출
현전 및 출현 후 실생식물 모잘록병, 뿌리 썩음병, 구경(crown) 썩음병, 손상, 도관 입고병 및 기타 다른 형태인 종종
전작물을 파괴시키는 증후들을 비롯한 복수의 생장 결함을 일으킬 수 있다.
진균 및 선충류와 관련된 질병을 방제하기 위하여 현재 다양한 시도가 이용되고 있다. 이러한 방법들은 종종 진균 세
포벽의 주성분이며 곤충, 선충류, 선충 난 또는 선충 포낭의 외벽 물질인 키틴의 분해 또는 붕괴에 근거하고 있다.
따라서, 제균제 또는 선충박멸제를 이용한 토양이나 식물의 화학적 처리 방법이 오랫동안 실시되고 있다. 또 다른 방
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법은 소위 키티나제로 불리는 키틴 분해 효소를 생산하여 병원균 성장을 억제하거나 방해하는 특정 돌연변이 박테리
아 균주 또는 자연발생의 박테리아 균주를 이용하는 것이다.
전자의 시도는 환경과 인간의 건강에 대한 화학적 살충제의 유해 영향에 의해 제한되는 반면, 후자의 시도는 다음과
같은 몇 가지 요인에 의해 제한된다.
그 하나는 사용된 박테리아에서 적당한 양의 키티나제가 생성되도록 키티나제 생성을 조절하는 능력이 부족하다는
점이다. 또 다른 단점은 식물-병원균 상호작용의 일반적 부위인 숙주 식물의 근권(즉, 뿌리)에서 군집하고 잔존하는
많은 키티나제 생산 박테리아의 능력이 제한적이라는 문제에서 기인하는 것이다. 뿌리에서의 박테리아의 키티나제
생산은 또한 다른 탄소원, 예컨대 뿌리에 의해 방출되는 대사산물의 존재로 인해 제한된다. 이러한 단점 중 몇 가지는
돌연변이 박테리아 균주를 사용함으로써 해결될 수 있지만, 이러한 균주는 키티나제 생산 농도가 감소된 형태로 복귀
되는 경우가 종종 있다.
전술한 단점을 극복하기 위하여 키티나제를 발현하는 식물을 유전자 조작하는 방법에 관한 수많은 보고가 있었지만,
도입된 유전자는 거의 전부 적당한 수준의 병원균 저항성을 부여하기에 충분히 높은 키티나제 활성을 나타내지 못하
였다.
이하 기술되고 후속되는 실시예 문단에서 설명되는 바와 같이 본 발명은 식충성 식물에서 유래되는 신규하면서 활성
이 매우 높은 키티나제를 제공한다.
식충성 식물은 트랩된 곤충의 외골격을 붕괴시키고 그 단백질 함유물을 분해시킬 수 있는 초과 활성의 단백분해 효소
를 함유하는 기제액(본 명세서에서는 '수프(soup)'라고도 부르기도 함)을 분비하는 것으로 이미 밝혀진 바 있지만[O
wen TP and Lennon KA(1999) American J. of Bot. 86:1382-1390], 식충성 식물의 조직이나 기제 수프가 키티나
제를 함유하고 있음은 종래 밝혀진 바 없다. 이하에 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 본 발명자들은 몇 가지 식충성
식물의 키티나제 폴리펩타이드와 키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 동정하고 분리할 수 있었다.
분리된 효소는 높은 키티나제 활성을 나타내고, 그 자체를 식물 및 포유동물 모두의 키틴 함유 병원균의 강력한 억제
제로서, 추정상의 생물동결방지 물질로서, 그리고 가능성 있는 과실의 감미제로서 다양한 상업적 용도에 사용할 수
있다.
따라서, 본 발명의 일 양태에 따르면, 네펜테스 종과 같은 식충성 식물의 조직이나 분비물로부터 제조된 단백질 추출
물을 포함하고 엔도키티나제 활성을 나타 내는 효소 조성물이 제공된다.
본 명세서에 사용된, '식충성 식물'이란 용어는 주로 곤충은 물론 다른 작은 동물을 유인하고 트랩하여 소화하도록 적
응된 식물을 의미한다. 식충성 식물의 예로는 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종
(Dionea sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.) 등이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 사용된 '엔도키티나제 활성'이란 용어는 키틴 분자내의 내부 베타-1,4 글리코사이드 결합을 절단하여 적
어도 3개의 GluNAc 단위로 이루어진 올리고머를 해리시키는 가수분해 효소의 성질을 의미한다.
본 명세서에 사용된 '단백질 추출물'이란 용어는 단백질을 포함하는 제제를 의미한다. 이것에는 고체 식물 추출물, 액
체 식물 추출물, 친수성 식물 추출물, 친지성 식물 추출물, 각 식물 구성요소 및 이의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발
명의 단백질 추출물은 엔도키티나제 활성을 나타내는 한 정제된 단백질 추출물, 부분 정제된 단백질 추출물 또는 미
정제 단백질 추출물일 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 구체예에 따르면, 효소 조성물은 바람직하게는 네펜테스 종의 트랩 또는 잎 조직이나 트랩 분
비물(예컨대 트랩 수프)에서 유래되는 것으로서, 엔도키티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을 포함한다(본
명세서에서 단백질 추출물의 '활성 분획'이라고도 부름).
이하에서는 본 발명의 효소 조성물의 단백질을 특성 규명하기 위한 생화학적, 면역학적 및 기능적 성질에 대한 포괄
적 분석방법을 제시한다.
이하 문단은 본 발명의 효소 조성물의 엔도키티나제 활성 단백질의 생화학적 성질과 면역학적 성질을 설명한다.
분자량 - 본 발명의 엔도키티나제 단백질은 환원 및 변성 조건하에 겔 전기영동으로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약
24 내지 27kDa, 약 30 내지 31kDa, 약 31 내지 33kDa, 약 32 내지 36kDa, 약 34 내지 38kDa인 단량체로서 활성을
나타낼 수 있다. 또한, 본 발명의 폴리펩타이드는 동종 또는 이종 서브유닛으로 이루어진 이량체 또는 삼량체와 같은
다중서브유닛 단백질로서 조합될 수 있다. 본 발명의 단백질은 그 자체가 비환원 조건하에서 겔 전기영동으로 측정했
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을 때 겉보기 분자량이 약 48 내지 54kDa, 약 60 내지 62kDa, 약 62 내지 66kDa, 약 64 내지 72kDa, 약 68 내지 약
76kDa, 약 76kDa 내지 약 100kDa인 것을 특징으로 한다.
엔도키티나제 활성 - 본 발명의 단백질은 분석 특이적 기질(실시예 문항에서 실시예 3 참조)을 사용하여 측정하고 분
광광도계 분석으로 410nm에서 니트로페놀 방출률을 모니터했을 때 엔도키티나제 활성이 있는 것을 특징으로 한다.
Km - 본 발명의 단백질은 세라티아 마르세슨스 키티나제와 비교했을 때 높은 Km 값을 가진 것으로 간주될 수 있으
나, 이 폴리펩타이드들은 반응 속도 대 기질 농도의 S자형 플롯이 관찰되는 바 명백히 미카엘리스-멘튼 모델을 따르
지 않는 것으로 추정되며, 이는 본 발명의 폴리펩타이드가 알로스테릭 효소임을 암시하는 것이다. 이는 키틴 유도가
이 폴리펩타이드의 효소 활성을 유의적으로 증가시킨다는 관찰과 본 발명의 효소가 1 이상의 서브유닛을 포함할 수
있다는 관찰에 의해 실증되고 있다(실시예 문항의 실시예 20 참조).
pI- 본 발명의 엔도키티나제 단백질의 pI값은 pH 10인 탄산염 완충액의 존재하에 FPLC 음이온 교환 컬럼에 대한
결합을 통해 측정했을 때 10 이하, 바람직하게는 7 내지 9 이다. 또한, 키티나제 활성이 200mM NaCl에서 용출된 분
획에서 이미 검출될 수 있다는 관찰은 pI 값이 비교적 높다는 것을 암시한다(실시예 문항의 실시예 6 참조).
항체 반응성- 트랩 조직 및 잎 유래의 키티나제 단백질과 달리 본 발명의 트랩 수프 키티나제 단백질은 세라티아 마
르세슨스 키티나제(ChiAII)에 대해 지향성인 폴리클론 항체와 반응하지 않는데, 이것은 이 단백질들이 세라티아 마르
세슨스 키티나제와 항원성 에피토프를 공유하지 않는다는 것을 시사하는 것이다(실시예 문항의 실시예 2 참조).
효소 안정성- 본 발명의 효소 조성물의 엔도키티나제 단백질은 일반적으로 pH 6.7에서 50℃하에 30분 동안 항온처
리 후 효소 활성을 보유하거나 pH 5에서 16시간 동안 37℃에서 항온처리 후 활성을 띤다.
본 발명의 효소 조성물은 또한 강한 항진균 활성을 나타낸다(실시예 문항의 실시예 9 내지 11 참조).
본 명세서에 사용된 바와 같이, '항진균 활성'은 진균 성장을 더욱 방지하는 정균 활성 및/또는 이미 존재하는 진균의
사멸을 촉진하는 제균 활성을 의미한다. 이하 실시예 문항에 제시된 결과로부터 명백히 알 수 있듯이, 본 발명의 효소
조성물은 종래 기술의 키티나제 효소와 비교했을 때 효과적이고 향상된 제균 활성을 나타낸다(실시예 문항의 실시예
9 내지 11 참조).
세라티아 키티나제와 달리, 본 발명의 효소 조성물의 항진균 활성은 제균성이며 농업적 및 치료적 목적에 그대로 사
용할 수 있다.
키티나제는 키틴을 함유하는 진균 세포벽을 가수분해하여 식물 방어 반응에 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이러한 가수분해 활성은 진균의 성장을 늦추고 식물 조직으로 병원균의 침입을 지연시키거나 방지한다. 본 발명의 효
소 조성물은 극히 높은 항진균 활성을 나타내므로(실시예 문항의 실시예 9 내지 11 참조), 인간 및 동물(예, 개, 고양
이, 양, 돼지, 말, 소, 인간 등)에서의 키틴 함유 병원균에 의해 유발된 감염을 치료하고 식물 및 식물 유래의 조직을 살
균하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물은 현재 이용되는 항진균 약물의 효능이 부족하다면 가능한 치료 수단으로서 특히 유리하다.
예를 들어, 칸디다 알비칸스 감염의 유일한 효과적 치료 방법은 종종 저혈압과 쇠약을 동반하는 심각한 부작용을 초
래하는 암포테리신 B의 정맥내 투여이다.
인간 또는 동물의 진균/박테리아 감염을 치료하는데 사용되는 경우, 본 발명의 효소 조성물은 활성 성분으로서, 바람
직하게는 국소 또는 경구 투여용으로 고안된 약학적 조성물에 포함되는 것이 좋다.
'치료'란 용어는 박테리아 감염과 관련된 증상을 경감 또는 감소시키는 것을 의미한다. 바람직하게는, 치료는 감염과
관련된 증상을 치유, 예컨대 실질적으로 제거하고(또는) 감염된 조직내의 박테리아 양을 실질적으로 감소시키는 것이
좋다.
본 명세서에 사용된 '약학적 조성물'이란 용어는 전술한 1종 또는 그 이상의 활성 성분 또는 이의 생리적 허용성 염 또
는 프로드럭과 다른 화학적 성분, 예컨대 생리적으로 적합한 담체 및 부형제를 함유한 조성물을 의미한다. 약학적 조
성물의 목적은 유기체에 대한 화합물의 투여를 용이하게 하기 위한 것이다.
이하, '약학적 허용성 담체' 및 '생리적 허용성 담체'라는 용어는 치료받는 개체에게 유의적 자극을 일으키지 않고 활
성 성분의 생물학적 활성과 성질을 손상시키지 않는 담체 또는 희석제를 의미하는 것으로서 호환적으로 사용된다.
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본 명세서에서 '부형제'라는 용어는 활성 성분의 투여를 더욱 용이하게 하기 위하여 약학적 조성물에 첨가되는 불활성
물질을 의미한다. 부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당과 다양한 종류의 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴,
식물성 옹리 및 폴리에틸렌 글리콜이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 약학적 조성물을 조제 및 투여하는 기법은 참고인용되는 약전['Remington's Parmaceutical Sciences', M
ack Publishing Co., Easton, PA, 최신판]을 참조할 수 있다.
적합한 투여 경로로는 예컨대 경구, 직장, 경점막, 장 또는 비경구 전달이 있으며, 그 구체적 예로는 근육내 주사, 피하
주사 및 골수내 주사는 물론 포막내 주사, 직접적인 심실내 주사, 정맥내 주사, 복강내 주사, 비내 주사 또는 안내 주사
가 있다.
또는, 전신 방식 보다는 국소 방식으로 약학적 조성물을 투여할 수도 있는데, 그 예로는 하기 기술되는 바와 같은 데포
또는 서방형 제제로서 종종 감염 부위에 직접 조성물을 주사하는 방식으로 투여할 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 당해 기술분야에 공지된 방법으로 제조할 수 있는데, 그 예로는 통상적인 혼합, 용해, 과
립화, 당의정 제조, 수파, 유화, 캅셀화, 트랩핑화 또는 동결건조 방법이 있다.
따라서, 본 발명에 따라 사용하기 위한 약학적 조성물은 약학적으로 사용될 수 있는 조성물로 활성 성분의 가공을 용
이하게 하는 부형제와 보조제를 포함하는 1종 이상의 생리적 허용성 담체를 사용하여 통상적인 방식으로 조제할 수
있다. 적당한 제형은 선택되는 투여 경로에 따라 달라진다.
주사용인 경우에, 본 발명의 활성 성분은 수용액으로, 바람직하게는 항크스액, 링거액 또는 생리적 식염수 완충액과
같은 생리적 상용성 완충액으로 제조할 수 있다. 경점막 투여용인 경우에는, 투과될 장벽에 적당한 투과제를 조제시
사용할 수 있다. 이러한 투과제는 일반적으로 당해 기술분야에 공지되어 있다.
경구 투여용인 경우에, 약학적 조성물은 당해 기술분야에 공지된 약학적 허용성 담체와 활성 성분을 배합하여 조제할
수 있다. 이러한 담체의 사용으로 인해 본 발명의 방법에 의해 사용된 약학적 조성물은 정제, 환제, 당의정, 캅셀, 액제
, 겔, 시럽, 슬러리, 현탁제 등과 같이 환자가 경구 섭취할 수 있도록 조제될 수 있다. 경구용 약리학적 조성물은 고체
부형제를 사용하고, 경우에 따라 최종 혼합물을 분쇄한 뒤, 그 과립 혼합물을 필요한 경우 적합한 보조제를 첨가한 다
음 가공하여 정제 또는 당의정 코어를 수득하는 방식으로 제조할 수 있다. 적합한 부형제는 구체적으로 락토스, 슈크
로스, 만니톨 또는 소르비톨 등의 당과 같은 충전제; 옥수수 전분 밀 전분, 쌀 전분, 감자 전분, 젤라틴, 검 트라가칸트,
메틸 셀룰로스, 하 이드록시프로필메틸 셀룰로스, 소듐 카르보메틸셀룰로스와 같은 셀룰로스 조성물; 및/또는 폴리비
닐피롤리돈(PVP)과 같은 생리적 허용성 중합체이다. 필요한 경우에는 가교된 폴리비닐 피롤리돈, 아가 또는 알긴산
또는 이의 염, 예컨대 알긴산나트륨 등과 같은 붕해제를 첨가할 수도 있다.
당의정 코어는 적합한 코팅제로 코팅될 수 있다. 이를 위하여 선택적으로 검 아라빅, 탈크, 폴리비닐 피롤리돈, 카르보
폴 겔, 폴리에틸렌 글리콜, 이산화티탄, 락커 용액 및 적합한 유기 용매 또는 용매 혼합물을 포함할 수 있는 당 농축 용
액을 사용할 수 있다. 상이한 조합의 활성 성분 용량을 식별하거나 특성화하기 위하여 염료 또는 안료를 정제 또는 당
의정 코팅제에 첨가할 수 있다.
경구적으로 사용될 수 있는 약학적 조성물로는 젤라틴으로 제조된 푸쉬-핏(push-fit) 캅셀은 물론 젤라틴과 가소제,
예컨대 글리세롤 또는 소르비톨로 제조된 연질 밀봉 캅셀이 있다. 푸쉬-핏 캅셀은 락토스와 같은 충전제, 전분과 같은
결합제, 탈크 또는 스테아르산마그네슘과 같은 윤활제 및 선택적인 안정화제와의 혼합물로 활성 성분을 포함할 수 있
다. 연질 캅셀에서는 활성 성분을 적합한 액체, 예컨대 지방산 오일, 액체 파라핀 또는 액체 폴리에틸렌 글리콜에 용해
또는 현탁시킬 수 있다. 또한, 안정화제를 첨가할 수도 있다. 경구 투여용 제제는 모두 선택된 투여 경로에 적합한 투
여량이어야 한다.
협측 투여의 경우, 조성물은 통상의 방식으로 조제된 정제 또는 로젠지 형태일 수 있다.
흡입 투여의 경우에, 본 발명에 따라 사용하기 위한 제제는 디클로로디플루 오로메탄, 트리클로로플루오로메탄, 디클
로로테트라플루오로에탄 또는 이산화탄소와 같은 적합한 추진제를 사용하여 가압 팩 또는 분무기로부터 에어로졸 분
무제 형태로 편리하게 전달될 수 잇다. 가압 에어로졸인 경우에, 투여량 단위는 계량된 분량을 전달하는 밸브를 제공
하여 측정할 수 있다. 흡입기 또는 공기 흡입기에 사용하기 위한 젤라틴 등의 캅셀과 카트리지에는 락토스 또는 전분
과 같은 적합한 분말 기제와 활성 성분의 분말 혼합물을 첨가하여 조제할 수 있다.
안과용 제제, 눈 연고, 분말, 용액 등도 본 발명의 범위에 속하는 것으로 고려되어야 한다.
본 명세서에 기술된 조성물은 환괴 주사 또는 연속 주입과 같은 비경구 투여용으로 조제될 수 있다. 주사용 제제는 단
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위 용량 형태, 예컨대 앰플 또는 다용량 용기 형태로, 경우에 따라 보존제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이 조성물은 오
일이나 수성 부형제 중에 현탁, 용해 또는 유화된 각각 현탁제, 용제 또는 유제로서, 현탁화제, 안정화제 및.또는 분산
제와 같은 조제용 제제를 포함할 수 있다.
비경구 투여용 약학적 조성물은 수용성 형태로 활성 성분의 수용액을 포함한다. 또한, 활성 성분의 현탁액은 적당한
오일 주사 현탁제로서 제조될 수 있다. 적합한 친지성 용액 또는 부형제로는 참깨유와 같은 지방산 오일이나 에틸 올
리에아트, 트리글리세라이드 또는 리포좀과 같은 합성 지방산 에스테르가 있다. 수성 주사 현탁제는 이 현탁제의 점
도를 증가시키는 물질, 예컨대 소듐 카르복시메틸 셀룰로스, 소르비톨 또는 덱스트란을 포함할 수 있다. 경우에 따라,
현탁제는 또한 조성물을 고농축 용액으로 만들 수 있도록 활성 성분의 용해성을 증가시키는 적합한 안정화제 또는 배
합제를 포함할 수 있다.
또는, 활성 성분은 적합한 부형제, 예컨대 멸균된 발열물질 제거된 물로 사용전에 구성되는 분말 형태일 수 있다.
본 발명의 조성물은 또한 코코아 버터 또는 다른 글리세라이드와 같은 통상의 좌약용 기제를 사용하여 좌약이나 보유
관장제와 같은 직장용 조성물로 조제될 수도 잇다.
전술한 제형 외에도, 본 발명의 조성물은 데포 조성물과 같은 국소 투여용으로 조제될 수도 있다. 이러한 장기간 작용
성 제제는 이식(예컨대, 피하 또는 근육내)이나 근육내 주사를 통해 투여할 수 있다. 예컨대, 이러한 조성물은 적합한
중합체 또는 소수성 물질(예컨대, 허용성 오일 중의 유제로서) 또는 이온 교환 수지와 배합하거나 또는 난용성 염과
같은 난용성 유도체로서 조제될 수 있다. 국소 투여용 제제로는 로션, 현탁제, 연고 겔, 크림, 드롭제, 액제, 분무 에멀
젼 및 분말이 있으며, 이에 국한되는 것은 아니다.
본 명세서에 기술된 약학적 조성물은 또한 적합한 고형의 겔상 담체 또는 부형제를 포함할 수 있다. 이러한 담체 또는
부형제의 예로는 탄산칼슘, 인산칼슘, 다양한 당, 전분, 셀룰로스 유도체, 젤라틴 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 중합체
가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
본 발명의 구성에 사용하기에 적합한 약학적 조성물은 활성 성분이 목적 용도를 달성하기에 효과적인 양으로 포함되
는 조성물을 포함한다. 보다 구체적으로, 치료적 유효량은 질병의 증상을 예방, 경감 또는 완화시키거나 또는 치료받
는 피검 체의 생존을 연장시키기에 효과적인 활성 성분의 함량을 의미한다.
치료적 유효량의 측정은 특히 본 명세서에 제시된 구체적인 실시예(실시예 문항의 실시예 9 내지 11 및 20)에 기초하
여 당업자의 역량으로 충분히 수행할 수 있다.
치료적 유효량 또는 용량은 우선 세포 배양 분석 및 무세포 분석으로부터 추정할 수 있다(실시예 문항의 실시예 9 내
지 11 및 20).
본 발명의 효소 조성물은 높은 항진균 활성을 나타내므로(실시예 문항의 실시예 9 내지 11 참조), 소량을 사용하여 다
양한 진균 질환을 치료할 수 있어 세포독성을 유발하지 않을 수 있다.
이에 상관없이, 본 명세서에 기술된 약학적 조성물의 독성 및 치료적 효능은 실험 동물 중에서 표준 약학적 절차에 따
라, 예컨대 시험 성분에 대한 IC 50및 LD 50(시험 동물의 50%를 사망시키는 치사 용량)을 측정하여 결정할 수 있다
. 이러한 분석을 통해 수득한 데이터는 인간에 사용하기 위한 투여량 범위를 조성하는데 사용할 수 있다. 이 투여량은
사용되는 투여량 형태 및 투여 경로에 따라 달라질 수 있다. 정확한 제형, 투여 경로 및 투여량은 환자 상태에 따라 담
당의사의 판단하에 선택될 수 있다[예컨대 Fingl, et al., 1975, in 'The Pharmacological Basis of Therapeutics', C
h.1 p.1].
투여량 함량과 간격은 최소 유효 농도(MEC)라고 하고 필요한 효과를 유지하기에 충분한 활성 성분의 혈장 농도를 제
공하도록 각각 조정될 수 잇다. MEC는 각 조성물 마다 다를 수 있으나, 시험관내 데이터, 예컨대 50 내지 90% 억제
를 제공하는데 필요한 농도(실시예 문항의 실시예 1 참조)로부터 추정할 수 있다. MEC를 제공하는데 필요한 투여량
은 개개인의 특성과 투여 경로에 따라 다를 수 있다. 혈장 농도를 측정하는 데에는 HPLC 분석이나 생물검정을 사용
할 수 있다.
투여량 간격 또한 MEC 값을 사용하여 결정할 수 있다. 조성물은 혈장 농도를 10 내지 90% 시간 동안, 바람직하게는
30 내지 90%, 가장 바람직하게는 50 내지 90% 시간 동안 MEC 이상으로 유지하는 섭생을 통해 투여되어야 한다.
국소 투여 또는 선택적 흡수인 경우에는 약물의 유효 국소 농도는 혈장 농도와 관련이 없을 수 있음을 유념해야 한다.
이런 경우에는 당해 기술분야에 공지된 다른 절차를 이용하여 유효 국소 농도를 측정할 수 있다.
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치료할 감염의 정도 및 반응성에 따라 용량은 서방형 조성물의 단독 투여로 제공될 수 있고, 치료 기간은 수일 내지
수주 또는 치료가 효과를 나타내거나 감염 상태가 감소될 때까지 지속한다.
투여될 조성물의 양은 물론 치료할 피검체, 감염 정도, 투여 방식, 처방하는 담당의사의 판단 등에 따라 달라질 수 있
다.
본 발명의 조성물은 분배기 장치에 FDA 승인을 얻은 키트의 일부분으로 구성되는 1회 또는 그 이상의 단위 투여량
형태로 포장될 수 있으며, 바람직하게는 사용, 투여량 및 부작용에 대한 설명서가 포함되는 것이 좋다. 이 키트는 예를
들어 환제 또는 정제를 함유하기에 적합한 발포 백과 같은 금속 또는 플라스틱 호일 또는 흡입기로서 사용하기에 적
합한 분배 장치를 포함할 수 있다. 이 키트는 또한 용 기와 관련된 고시를 약제의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정
부 기관이 지시한 형태로 수반할 수 있으며, 상기 고시는 조성물의 형태 또는 인간용 또는 수의용도에 관한 정부기관
의 승인을 반영하는 것이다. 이러한 고시는 예를 들어 처방 약물에 대한 미국 식약청이 승인한 라벨이거나 승인된 제
품 삽입물일 수 있다. 본 발명에 사용하기에 적합한 활성 성분을 함유하는 조성물은 또한 적합한 용기에 제조, 배치될
수 있고, 표시된 질환이나 증상의 치료용으로 표지될 수 있다.
전술한 약학적 조성물은 다양한 키틴 함유 병원균 감염, 예컨대 비제한적으로 진균 감염(예컨대, 피부 진균증, 피하
진균증, 폐 진균증, 칸디다증), 원생생물 감염[예, 톡소플라스마병, 말라리아(플라스모듐 종), 레이슈마니아증(레이슈
마니아 종), 샤가스 병, 수면증(트립파노소마 종)] 및 기생충 감염(예, 주혈흡충증, 선모충증, 필라리아증, 사상충증 진
균 감염)을 치료하는데 사용할 수 있다.
본 발명의 효소 조성물은 또한 진균, 선충류, 곤충 및 질병 인자를 포함하는 키틴 함유 병원균을 퇴치하거나 사멸시키
는 살충제로서의 유의적인 용도에 사용될 수 있다. 예를 들어, 진균 병원균으로는 푸사리움, 파이튬, 파이토프토라, 베
르티실륨, 라이족토니아, 마크로포미나, 트엘라비옵시스, 스클레로티니아 등을 비롯한 다양한 속의 진균 종이 있다.
진균에 의해 일어나는 식물 질병으로는 출현전 및 출현 후 실생식물 모잘록병, 자엽 하부 썩음병,뿌리 썩음병, 구경(cr
own) 썩음병, 도관 입고병 및 기타 다른 형태의 증상 발생을 포함한다. 선충류 병원균으로는 멜로이도진, 헤테로데라,
디틸렌처스, 프라틸렌처스 속 유래의 선충류 종이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 선충류에 의해 일어나는 식
물 질병으로는 뿌리혹, 뿌 리썩음병, 손상, '뭉툭한' 뿌리, 발육 저지 및 병원성 진균에 의한 감염 증가와 관련된 다른
다양한 썩음병 및 입고병이 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 일부 선충류(예, 트리코도러스, 로나이도러스, 자이
페네마)는 다양한 식물, 예컨대 프루너스(Prunus), 포도, 담배 및 토마토 등에서 나타나는 바이러스 질환의 벡터로서
작용할 수 있다. 이 조성물은 또한 이하 상세한 설명에 기술되는 바와 같이 생물학적 부동 물질, 냉해 손상에 대비한
식물 보호제 및 가능하다면 과실의 감미제로서 사용될 수 있다.
따라서, 본 발명의 효소 조성물은 바람직하게는 농업적 허용성 담체를 포함하기도 하는 농업용 조성물에 첨가될 수
있다.
농업적 허용성 담체는 고체 또는 액체, 바람직하게는 액체, 보다 바람직하게는 물일 수 있다. 필수적인 것은 아니지만,
본 발명의 농업용 조성물은 다른 첨가제, 예컨대 비료, 불활성 배합 보조제, 즉 계면활성제, 유화제, 소포제, 염료, 증
량제 등을 포함할 수 있다. 농업용 조성물의 제조 및 적용 방법을 기술하는 문헌은 많이 있는데, 그 예로는 다음과 같
다. [Couch and Ignoffo(1981) in Microbial Control of Pests and Plant Disease 1970-1980, Burges(ed.), chapt
er 34, pp. 621-634; Corke and Rishbeth, 상기 서적, chapter 39, pp.717-732; Brockwell(1980) in Methods for
Evaluating Nitrogen Fixation, Bergersen(ed.) pp.417-488; Burton(1982) in Biological Nitrogen Fixation Tech
nology for Tropical Agriculture, Graham and Harris(eds.)pp. 105-114; Roughley(1982) 상기 서적, pp.115-12
7; The Biology of Baculoviruses, Vol.II, 상기 문헌 및 이 문헌 들에 인용된 참조문헌.] 곤충 구제에 사용하기 위한
바큘로바이러스를 함유하는 습윤성 분말 조성물은 본원에 참고인용된 EP697,170에 기술되어 있다.
본 발명의 농업용 조성물을 적용하는 바람직한 방법은 전체적으로 본원에 인용된 미국 특허 제5,039,523호에 개시된
바와 같은 잎 적용, 종자 코팅 및 토양 적용이 있다.
본 발명의 키티나제 함유 식충성 식물 조성물의 중요성과 산업상 이용가능성으로 인해, 본 발명자들은 식충성 식물
유래의 전술한 엔도키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 동정 및 분리하게 되었다.
따라서, 본 발명의 다른 양태에 따르면 본 발명은 식충성 식물 조직에서 분리되고 자체적으로(단량체로서) 또는 다량
체 단백질의 일부분으로서 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 암호화하는 게놈 상보성 또는 합성 폴리뉴
클레오타이드 서열을 제공한다.
본 명세서에 사용된 '상보성 폴리뉴클레오타이드 서열'이란 용어는 본래 역전사효소 또는 임의의 다른 RNA 의존적 D
NA 폴리머라제를 사용하여 mRNA를 역전사하여 얻어지는 서열을 의미한다. 이러한 서열은 이어서 DNA 의존적 DN
A 폴리머라제를 사용하여 생체내 또는 시험관내에서 증폭시킬 수 있다.
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본 명세서에 사용된 '게놈 폴리뉴클레오타이드 서열'이란 용어는 염색체에서 유래하여 염색체의 인접 부분을 반영하
고 있는 서열을 의미한다.
본 명세서에 사용된 '합성 폴리뉴클레오타이드 서열'이란 용어는 적어도 부분적으로는 상보성이고 적어도 부분적으로
는 게놈성인 서열을 의미한다. 복합 서열 은 본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는데 필요한 약간의 엑손 서열 뿐만
아니라 엑손 서열 사이에 개재된 약간의 인트론 서열을 포함할 수 있다. 인트론 서열은 임의의 기원의 것일 수 있으며,
일반적으로 보존적 결찰 시그널 서열을 포함한다. 이러한 인트론 서열은 또한 시스 작용성 발현 조절 인자를 포함할
수 있다.
이와 같은 본 발명의 양태의 바람직한 일 구체예에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 5와 적
어도 70%, 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상, 즉 95% 내지 100% 동일
한 폴리펩타이드를 암호화한다.
이러한 동일성 및/또는 서열 상동성은 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman) 알고리듬과 다음과 같은 변수(즉,
갭 형성 패널티 값이 9이고 갭 연장 패널티 값이 2)를 사용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소
프트웨어와 같은 컴퓨터용 소프트웨어를 사용하여 측정할 수 있다.
이와 같은 본 발명의 양태의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 6과
적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상, 즉 95% 내지 100% 동일한 폴리펩
타이드를 암호화한다.
이와 같은 본 발명의 양태의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 7과
적어도 81%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상, 즉 95% 내지 100% 동일한 폴리펩타이드를 암호
화한다.
이와 같은 본 발명의 양태의 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 분 리된 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 8과
적어도 77%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90%, 적어도 95% 또는 그 이상, 즉 95% 내지 100% 동일한 폴리펩
타이드를 암호화한다.
이와 같은 본 발명의 양태에 속하는 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 암호화된 폴리펩타이드는 적어도 30개, 적어
도 32개, 적어도 34개, 적어도 36개, 즉 38개의 아미노산을 가진 시그널 펩타이드를 포함한다. 이러한 시그널 펩타이
드는 서열번호 47에 기재된 것으로서, 단백질 분비를 위해 사용되는 것으로 추정된다(실시예 문항의 실시예 14 참조)
.
이와 같은 본 발명의 양태에 속하는 또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 암호화된 폴리펩타이드는 적어도 10개 내지
15개 이하의 프롤린 아미노산을 특징으로 하는 프롤린 고밀도 영역을 포함한다(서열번호 49 참조). 이 프롤린은 추정
상의 글리코실화 부위로서 작용하고 단백질 분비와 단백질 상호작용에 중요한 역할을 할 수 있다[Liu et al. J Biome
d Sci 1994 Mar;1(2):65-82].
또 다른 바람직한 구체예에 따르면, 본 발명의 이와 같은 양태에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 3 또는 4
에 기재된 것이거나 이의 활성 부분이다. 본 명세서에 사용된 '활성 부분'이란 용어는 키티나제 활성(즉, 촉매 도메인)
및/또는 기질 인식(즉, 시스테인 고밀도 도메인)을 보유하는 키티나제의 일부분을 의미한다.
대안적으로 또는 부가적으로, 본 발명의 이러한 양태에 따른 폴리뉴클레오타이드는 서열번호 1, 2, 3 또는 4와 하이
브리드할 수 있다.
긴 핵산의 하이브리드화는 엄중 또는 보통 하이브리드화 조건하에 실시되는 것이 바람직한데, 이 때 엄중 하이브리드
화는 10% 황산덱스트란, 1M NaCl, 1% SDS 및 5x10 6cpm 32p 표지된 프로브를 함유하는 하이브리드화 용액으로
65℃에서 실시하고 최종 세척 용액은 0.2xSSC 및 0.1% SDS를 사용하고 65℃에서 최종 세척하는 반면, 보통 하이브
리드화는 10% 황산덱스트란, 1M NaCl, 1% SDS 및 5x10 6cpm 32p 표지된 프로브를 함유하는 하이브리드화 용
액으로 65℃에서 실시하고 최종 세척 용액은 0.1xSSC 및 0.1% SDS를 사용하고 50℃에서 최종 세척하는 것이다.
즉, 이와 같은 본 발명의 양태는 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를
제공한다. 이와 같은 본 발명의 분리된 폴리뉴클레오타이드는 다양한 단세포 또는 다세포 발현계에서 발현될 수 있고,
이로부터 회수된 재조합 폴리펩타이드는 본 발명의 효소 조성물과 관련하여 전술한 바와 같은 약학적 및 농업적 용도
에 사용될 수 있다.
단세포계에서의 발현을 위하여 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 적당한 발현 벡터(즉, 작제물)에 클로닝한다.
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사용된 숙주/벡터계에 따라, 구성성 및 유도성 프로모터, 전사 인헨서 인자, 전사 종결인자 등을 비롯한 다수의 적합한
전사 및 해독 인자가 상기 발현 벡터에 사용될 수 있다[예컨대, Bitter et al.,(1987) Methods in Enzymol. 153:516-
544].
삽입된 암호 서열의 전사 및 해독에 필요한 인자 외에도 본 발명의 이러한 양태의 발현 벡터는 발현된 폴리펩타이드
의 안정성, 생산성, 정제, 수율 또는 독성 을 향상시키기 위해 유전자조작된 서열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 본 발
명의 폴리펩타이드와 이종 단백질을 함유하는 융합 단백질 또는 절단가능한 융합 단백질의 발현이 유전자조작될 수
있다. 이러한 융합 단백질은 친화성 크로마토그래피로 용이하게 분리되도록 고안될 수 있다. 예컨대 이종 단백질에
특이적인 컬럼 상에 고정화시켜 사용할 수 있다. 절단 부위가 목적 단백질(즉, 키티나제)과 이종 단백질 사이에 위치
하도록 조작된 경우에, 키티나제 단백질은 절단 부위를 붕괴시키는 적당한 효소 또는 제제로 처리함으로써 크로마토
그래피 컬럼으로부터 방출시킬 수 있다[예컨대, Booth et al.(1988) Immunol.Lett.19:65-70; 및 Gardella et al.,(19
90) J.Biol.Chem. 265:15854-15859].
다양한 세포가 키티나제 암호 서열을 발현시키는 숙주 발현계로서 사용될 수 있다. 그 예로는, 미생물, 예컨대 키티나
제 암호 서열을 함유하는 재조합 박테리오파지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된
박테리아; 키티나제 암호 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모; 알칼리성 키티나제 암호 서열
을 함유하는 Ti 플라스미드와 같은 재조합 플라스미드 발현 벡터로 형질전환되거나 또는 재조합 바이러스 발현 벡터(
예, 꽃양배추 모자이크 바이러스, CaMV; 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염된 식물 세포계(이하 명세서에 상세
히 설명됨)가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다. 포유동물 발현계도 키티나제 발현에 사용할 수 있다. 박테리아계
는 본 발명에 따라 재조합 키티나제를 수득하는데 사용되어, 저비용으로 높은 생산량을 제공할 수 있어 바람직하다.
박테리아계에서는 발현되는 키티나제에 요구된 용도에 따라 다수의 발현 벡 터를 유리하게 선택할 수 있다. 예를 들
어, 다량의 키티나제가 필요한 경우에는 다량의 단백질 산물의 발현을 유도하고, 발현된 산물이 용이하게 정제되는
배양액이나 발현된 산물을 박테리아의 페리플라슴으로 유도하는 소수성 시그널 서열과 융합체로서 제공될 수 있는
벡터가 바람직할 것이다. 또한, 키티나제 회수를 돕기 위해 특정 절단 부위가 조작되어진 특정 융합 벡터가 필요할 수
도 있다. 이러한 조작으로 변조된 벡터로는 대장균 발현 벡터의 pET 시리즈[Studier et al.(1990) Methods in Enzy
mol. 185:60-89]가 있으며, 이것에 국한되는 것은 아니다.
식물로부터 클로닝된 키티나제의 사용된 코돈을 대장균에서 발현시키는데 부적당한 경우에, 숙주 세포는 대장균에서
는 드물지만 식물에서는 흔히 사용되는 tRNA 종을 암호화하는 벡터와 공동형질전환시킬 수 있다. 예를 들어 대장균
에서 드문 tRNA인 tRNA ArgAGA/AGG 를 암호화하는 유전자 dnaY의 공동형질감염은 대장균에서 이종 유전자를 다량
으로 발현시킬 수 있다[Brinkmann et al., Gene 85:109(1989) 및 Kane, Curr.Opin.Biotechnol. 6:494(1995)]. dna
Y 유전자는 또한 pUBS 벡터(미국 특허 제6,270,0988호)와 같은 발현 작제물에 포함시킬 수 있다.
효모에는, 미국 특허 제5,932,447호에 개시된 바와 같은 구성성 또는 유도성 프로모터를 함유하는 다수의 벡터가 사
용될 수 있다. 또는, 효모 염색체내로 이종 DNA 서열의 통합을 촉진하는 벡터가 사용될 수도 있다.
당해 기술분야에 공지된 곤충 및 포유동물 숙주 세포계와 같은 다른 발현계도 본 발명에 사용될 수 있다.
형질전환된 세포는 다량의 재조합 키티나제를 발현시키는 조건하에 배양한다. 이러한 조건으로는 단백질 생산을 허
용하는 배지, 생물반응기, 온도, pH 및 산소 조건이 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다. 배지는 세포가 배양되어 본
발명의 재조합 키티나제 단백질을 생산하는 모든 배지를 의미한다. 이러한 배지는 일반적으로 동화성 탄소, 질소 및
인산염 원과, 적당한 염, 무기물, 금속 및 다른 영양소, 예컨대 비타민을 함유한 수용액을 포함한다. 본 발명의 세포는
통상적인 발효 생물반응기, 진탕 플라스크, 시험관, 미량역가 접시 및 페트리접시에서 배양될 수 있다. 배양은 재조합
세포에 적당한 온도, pH 및 산소 함량에서 실시될 수 있다. 이러한 배양 조건은 당업자의 지식내에서 선택될 수 있는
것이다.
생산에 사용된 벡터 및 숙주계에 따라 본 발명의 최종 단백질은 재조합 세포내에 보유되거나, 발효 배지로 분비되거
나, 두 세포막 사이의 공간, 예컨대 대장균의 페리플라슴 공간으로 분비되거나, 또는 세포막 또는 바이러스 막의 표면
상에 보유될 수 있다.
재조합 단백질의 회수는 적당한 배양 시간 후 실시한다. '재조합 단백질의 회수'라는 용어는 그 단백질을 함유하는 전
체 발효액을 수거하는 것을 의미하는 것으로서, 추가 분리 또는 정제 단계를 반드시 포함할 필요는 없다. 이와 반대의
의미는 아니지만, 본 발명의 단백질은 다양한 표준 단백질 정제 기법을 사용하여 정제할 수 있으며, 그 예로는 친화성
크로마토그래피, 이온 교환 크로마토그래피, 여과, 전기영동, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 겔 여과 크로마토그래
피, 역상 크로마토그래피, 콘카나발린 A 크로마토그래피, 크로마토포커싱 및 차등가용화 등이 있으며, 이에 한정되는
것은 아니다.
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본 발명의 재조합 엔도키티나제 단백질은 전술한 약학적 조성물 및 농업용 조성물에 사용하기 위하여 '실질적으로 순
수한' 형태로 회수되는 것이 바람직하다. 본 명세서에 사용된 '실질적으로 순수한'이란 용어는 전술한 다양한 용도에
그 단백질의 유효 용도를 제공할 수 있는 순도를 의미한다.
이하 실시예 문항의 실시예 19에 제시된 바와 같이, 수많은 식충성 식물 종은 본 발명의 엔도키티나제와 유사한 엔도
키티나제를 암호화하는 발현성 폴리뉴클레오타이드를 포함한다.
따라서, 본 발명에 의해 제공되는 폴리뉴클레오타이드 및 폴리펩타이드 서열 정보를 사용하여 엔도키티나제를 암호
화하는 식충성 식물의 또 다른 폴리뉴클레오타이드 서열을 동정 및 분리할 수 있다. 이러한 동정과 분리는 PCR 증폭,
라이브러리 선별 등(이하 실시예 문항에서 상세히 설명됨)을 비롯한 당해 기술분야에 공지된 분자생물학 및 생화학적
방법을 사용하여 실시할 수 있다.
또한, 본 발명의 폴리펩타이드 고유의 생화학적 특성에 따른 서열 정보를 사용하여 다른 식충성 식물 유래의 미정제
또는 정제된 키티나제 활성 분획을 분리할 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 식충성 식물로부터 높은 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를
분리하는 방법이 제공된다.
이 방법은 그 다음 식충성 식물의 조직(즉, 트랩 또는 잎) 또는 트랩 분비물(예, 낭상엽 식물의 트랩 수프)로부터 단백
질 추출물을 제조함으로써 실시된 다.
단백질 추출 후 키티나제 활성 분획을 분리하고 산성 분획으로부터 높은 키티나제 활성을 나타내는 각각의 폴리펩타
이드를 이하 상세히 설명되는 키티나제 활성 분석법을 사용하여 동정한다.
마지막으로, 키티나제 활성이 향상된 폴리펩타이드를 생화학적으로 특성규명하고(예컨대, pH 및 온도 감수성, 분자
량, 환원/비환원 조건하에서의 활성, pI, 엔도/엑소-키티나제 활성 등, 이하 실시예 문항 참조), 살균(예컨대, 항진균)
활성을 기능적으로 검정한다.
전술한 방법은 폴리펩타이드 분리를 용이하게 하기 위하여 먼저 전식물의 상태하에서 키티나제 활성을 유도하는 것
이 바람직하다는 것은 당연하다. 이것은 식물 호르몬(예컨대, 에틸렌), 열충격, 화학물질, 병원균, 산소부족, 빛, 스트
레스 등과 같은 다양한 내부 및 외부 인자에 의해 실시될 수 있다. 본 방법론에 따른 바람직한 유도 프로토콜은 키틴
유도이다(실시예 문항의 실시예 7 참조).
식물 단백질 추출물의 제조는 당해 기술분야에 공지된 모든 표준 단백질 추출 방법으로 수행할 수 있다. 단백질 추출
방법의 선택은 활성 폴리펩타이드의 조직 분포 및 그 세포 국재화에 따라 달라질 수 있다. 식물 세포의 아포플라즘 또
는 세포간 공간으로 분비되지 않는 단백질인 경우에는, 목적 단백질을 방출 및 포집하기 위하여 식물 세포벽을 용해
시키는 절차를 이용해야 한다. 식물 단백질 추출 방법에 대해서는 문헌[Cunningham C and Porter AJR(1998) 'Rec
ombinant protein from plants' Humana Press Totowa N.J.]에 검토되고 있다.
분비된 또는 아포플라스트 단백질은 단순히 분비액을 수집하여 추출할 수 있으나, 근접 세포를 붕괴시키지 않는 조치
가 이루어져서 분비된 단백질을 단백분해 또는 변성 환경에 노출시키지 않아야 한다.
바람직하게는, 분비된 또는 아포플라스트 단백질의 추출물은 잎이나 트랩과 같은 당해 조직에 5mM EDTA, 10mM
아스코르브산, 10mM 머캅토에탄올, 1mM 페닐메틸 설포닐플루오라이드, 2mM 카프로산 및 2mM 벤즈아미딘을 진
공 침윤시켜 제조한다. 진공침윤은 마우치 및 스테헬린[Mauch and Staehelin, The plant Cell 1:447-457(1989)]에
기술된 방법에 따라 실시한다. 처리된 조직은 깔대기에 수직으로 충진하고 조직이 구부러지지 않도록 원심분리관에
넣는다. 깔대기에 충진된 조직을 가지고 이를 원심분리하여 조직의 세포를 붕괴시킴이 없이 세포외 침윤물을 분리시
키고, 이를 원심분리관에 추출물로서 포집한다.
수거한 추출물을 그 다음 키티나제 활성에 대해 분석한다. 일반적으로, 키티나제 활성은 콜로이드성 키틴으로부터 글
루코사민의 효소적 방출(엑소키티나제) 및 키틴 올리고머로부터 글루코사민의 효소적 방출(엔도키티나제)로 측정할
수 있다.
키티나제 활성은 겔내 활성 분석으로 분석할 수 있다(실시예 문항의 실시예 1 참조). 시료(즉, 단백질 추출물 분획)은
블랙쉬어(Blackshear, 1984)에 의해 종래 기술된 바와 같이 천연 폴리아크릴아마이드 미니겔에서 전기영동시킨다.
전기영동 후 이 겔을 기질로서 글리콜 키틴을 함유하는 폴리아크릴아마이드 겔과 중층시키고 트루델과 어셀린[Trud
el and Asselin (1989) Analytical Biochemistry 178:362-366]의 절차에 따라 효과적인 조건하에 항온처리한다.
키티나제 활성 밴드 는 자외선하에서 관찰할 때 칼코플루오르에 의한 염색의 부재를 통해 검출한다.
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대안적으로, 키티나제 활성은 유사체인 p-니트로페닐-β-D-N,N',N'-트리아세틸키토바이오스(Sigma IL)를 사용하
여 측정할 수 있다. 이 분석법은 나노정제 수에 용해시킨 기질 및 단백질 추출물 분획과 함께 CaCl 2 을 함유하는 KH
2 PO 4 완충액(pH 6.7)을 첨가한 ELISA 평판에서 실시한다. 반응은 50℃에서 30분 후 종결시키고, ELISA 평판 판
독기로 405nm에서 흡광도를 측정한다. 대조군은 효소 또는 기질만에 의한 임의의 흡광도를 측정하기 위하여 사용한
다. 이 시료에 의해 방출된 p-니트로페놀은 표준 곡선을 사용하여 계산한다. 효소 활성 단위는 분석 조건하에 분당 방
출된 p-니트로페놀의 몰 수로 측정한다.
키티나제 활성 분획이 확인되면 목적 폴리펩타이드를 임의의 적합한 정제 절차(실시예 문항의 실시예 6 참조)에 따라
농축 정제할 수 있다. 이러한 절차에는 비제한적으로 단백질 침전, 발포 베드 크로마토그래피, 한외여과, 음이온 교환
크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래프, 소수성-상호작용 크로마토그래피, HPLC, FPLC 및 친화성 크로마토
그래피(예컨대, 키틴 컬럼 상에서)가 있으며, 이들은 본원에 전체적으로 인용되는 미국 특허 제6,284,875호에 개시되
어 있다. 몇 가지 단백질 정제 기법에 대한 일반적 논의는 본원에 참고인용되는 문헌[Jervis et al., Journal of Biotec
hnology 11:161-198(1989)]에 제공되어 있다.
전술한 방법론을 사용하여 본 발명자들은 3가지 추가 식충성 식물 속(디오네아 종, 드로세라 종 및 사라세니아 종)으
로부터 엔도키티나제계 효소의 성분을 추 가적으로 발견하였다.
단백질 생산의 주형으로서의 역할 외에, 본 발명의 키티나제 암호화 폴리뉴클레오타이드는 다양한 용도에 사용할 수
있다.
즉, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 키틴 함유 병원균에 대한 식물의 감수성을 감소시키는 방법이 제공된다.
이 방법은 본 발명의 키티나제 활성이 높은 폴리펩타이드를 식물내에서 정규 장소외에서 발현시킴으로써 수행되어진
다.
식물에서의 폴리펩타이드 발현은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열로 식물을 형질전환시킴으로써 실시되어진다.
식물 형질전환을 실시하기 위하여 엔도키티나제를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 식물 세포 또는 조직으로 외인
성 폴리뉴클레오타이드의 도입을 용이하게 하고 그 식물내에서 효소를 발현시키는 작용을 하는 핵산 작제물 내에 포
함시키는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 핵산 작제물은 전체 식물, 일정한 식물 조직 또는 일정한 식물 세포 내에서 본 발명의 키티나제 암호
화 폴리뉴클레오타이드를 일시적 방식 또는 바람직하게는 안정된 방식으로 발현시키는데 이용된다.
따라서, 본 발명의 바람직한 구체예에 따르면, 상기 핵산 작제물은 본 발명의 키티나제 암호화 폴리뉴클레오타이드의
발현을 조절하는 프로모터를 추가로 포함한다.
조직 특이적이거나, 발생학적으로 특이적이거나 구성성이거나 유도성일 수 있는 다양한 식물의 기능성 발현 프로모
터 및 인헨서는 본 발명의 작제물에 이용될 수 있으며, 그 몇 가지 예가 이하에 제공된다.
본 명세서 및 후속되는 청구의 범위에 사용된 '식물 프로모터' 또는 '프로모터'라는 용어는 식물 세포 (DNA 함유 세포
기관 포함) 내에서 유전자 발현을 유도할 수 있는 프로모터를 포함한다. 이러한 프로모터는 식물, 박테리아, 바이러스,
진균 또는 동물 기원으로부터 유래하는 것일 수 있다. 이러한 프로모터는 구성성, 즉 복수의 식물 조직에서 다량의 유
전자 발현을 유도할 수 있거나, 조직 특이성, 즉 특정 식물 조직에서 유전자 발현을 유도할 수 있거나, 유도성, 즉 자극
하에 유전자 발현을 유도할 수 있거나, 키메라성, 즉 2종 이상의 다른 프로모터의 부분들로 구성된 것일 수 있다.
즉, 사용된 식물 프로모터는 구성성 프로모터, 조직 특이적 프로모터, 유도성 프로모터 또는 키메라성 프로모터일 수
있다.
구성성 식물 프로모터의 예로는 CaMV35S 및 CaMV19S 프로모터, FMV34S 프로모터, 사탕수수 바실러스형 배드나
바이러스 프로모터, CsVMV 프로모터, 아라비돕시스 ACT2/ACT8 액틴 프로모터, 아라비돕시스 유비퀴틴 UBQ1 프
로모터, 보리 잎 티오닌 BTH6 프로모터 및 쌀 액틴 프로모터가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
조직 특이적 프로모터의 예로는 콩 페이스올린 저장 단백질 프로모터, DLEC 프로모터, PHSβ프로모터, 옥수수 저장
단백질 프로모터, 대두의 콘글루틴 감마 프로모터, AT2S1 유전자 프로모터, 아라비돕시스의 ACT11 액틴 프로모터,
브라시카 나푸스 유래의 napA 프로모터 및 감자 파타틴 유전자 프로모터가 있으며, 이에 한 정되는 것은 아니다.
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유도성 프로모터는 예컨대 빛, 온도, 화학물질, 가뭄, 높은 염도, 삼투압 충격, 산화제 조건을 포함하는 스트레스 조건
과 같은 특정 자극이나 병원성의 경우에 유도되는 프로모터로서, 완두 rbcS 유전자 유래의 광유도성 프로모터, 알파
파 rbcS 유전자 유래의 프로모터, 가뭄에 활성적인 프로모터 DRE, MYC 및 MYB; 고염도와 삼투압 스트레스에 활성
적인 프로모터 INT, INPS, prxEa, Ha hsp17.7G4 및 RD21; 및 병원성 스트레스에 활성적인 프로모터 hsr203J 및 st
r246C가 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 작제물은 예컨대 항생제 내성 유전자와 같은 적당하고 고유한 선택성 마커를 추가로 포함하는 것이
바람직하다. 본 발명에 따른 보다 바람직한 구체예에서 작제물은 복제 오리진을 추가로 포함하는 것이 좋다.
본 발명에 따른 작제물은 대장균에서 전파시킬 수 있고(작제물이 적당한 선택성 마커와 복제 오리진을 포함하는 경우
) 식물 세포에서 전파시키거나 식물 게놈내에 통합시키기에 적합할 수 있는 셔틀 벡터일 수 있다.
핵산 작제물을 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물로 도입시킬 수 있는 방법은 다양하다(Potrykus, I., Annu.Rev.Plant.Phys
iol., Plant.Mol.Biol. (1991) 42:205-225; Shimamoto et al., Nature(1989) 338:274-276). 이러한 방법은 식물 게
놈 내로 핵산 작제물 또는 그 일부를 안정하게 통합시키는 것인지 또는 핵산 서열이 식물의 후손으로 유전되지 않는
핵산 작제물의 일시 발현을 위한 것인지에 따라 선택된다.
본 발명의 핵산 작제물내에 포함된 것과 같은 외인성 서열을 식물 게놈 내로 안정되게 게놈적으로 통합시킬 수 있는
방법의 원리는 2가지가 있다:
(i) 아그로박테리움 매개의 유전자 전이법: Klee et al.(1987) Annu.Rev.Plant Physiol. 38:467-486; Klee and Rog
ers in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular Biology of Plant Nuclear Genes, ed
s. Schell, J., and Vasil.L.K., Academic Publishers, San Die해, Calif.(1989) p.2-25; Gatenby, in Plant Biotechn
ology, eds. Kung,S. and Arntzen, C. J., Butterworth Publishers, Boston, Mass.(1989) p.93-112.
(ii) 직접 DNA 흡수법: Paszkowski et al., in Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants, Vol.6, Molecular
Biology of Plant Nuclear Genes eds. Schell, J., and Vasil, L.K., Academic Publishers, San Diego., Calif.(1989)
p.52-68; 원형질내로 DNA를 직접 흡수시키는 방법 포함, Toriyama,K. et al.(1988) Bio/Technology 6:1072-107
4. 식물 세포의 순간 전기 충격에 의해 유도된 DNA 흡수: Zhang et al. Plant Cell Rep.(1988) 7:379-384. Fromm
et al. Nature(1986) 319:791-793. 입자 충격에 의한 식물 세포 또는 조직내로의 DNA 주입법, Klein et al. Bio/Te
chnology (1988) 6:559-563; McCabe et al. Bio/Technology (1988) 6:923-926; Snaford, Physiol.Plant. (199)
79:206-209; 미량피펫 시스템 사용하는 방법: Neuhaus et al., Theor.Appl.Genet. (1987) 75:30-36; Neuhaus an
d Spangenberg, Physiol.Plant. (1990) 79:213-217; 또는 발아 화분과 DNA의 직접 배양법, DeWet et al. in Exper
imental Manipulation of Ovule Tissue, eds. Chapman, G.P. and Mantell, S.H. and Daniels, W.Longman, Londo
n,(1985) p.197-209; 및 Ohta, Proc.Natl.Acad.Sci. USA(1986) 83:715-719.
아그로박테리움 시스템은 식물 게놈 DNA로 통합되는 일정한 DNA 분절을 포함하는 플라스미드 벡터의 사용을 포함
한다. 식물 조직의 접종 방법은 식물 종과 아그로박테리움 전달계에 따라 달라진다. 널리 사용되는 방법은 전체 식물
분화를 개시시키기에 우수한 공급원을 제공하는 임의의 조직 외식편을 사용하여 실시할 수 있는 잎반(leaf disc) 절차
이다.[Horsch et al. in Plant Molecualr Biology Manual A5, Kluwer Academic Publishers, Dordrecht (1988) p.
1-9]. 보강된 방법은 아그로박테리움 전달 시스템을 진공 침윤과 함께 사용하는 것이다. 아그로박테리움 시스템은 특
히 돌연변이 쌍자엽 식물 형성시에 존속가능하다.
식물 세포로 직접 DNA를 전달할 수 있는 방법은 많다. 전기침투법의 경우에는 원형질을 강한 전기장에 순간 노출시
킨다. 미량주입법의 경우에는 DNA를 매우 작은 미세피펫을 사용하여 세포내로 직접 기계적으로 주입시킨다. 미량입
자 충격법의 경우에는 DNA는 황산마그네슘 결정, 텅스텐 입자 또는 금 입자와 같은 마이크로프로젝타일(microproje
ctile) 상에 흡착되고, 이 마이크로프로젝타일은 세포 또는 식물 조직 내로 물리적으로 가속화된다.
형질전환 후 식물 번식을 실시한다. 식물 번식의 가장 일반적인 방법은 종자를 이용하는 방법이다. 하지만, 종자 번식
에 의한 재생은 종자가 멘델 법칙에 의해 좌우되는 유전자 변수에 따라 식물에 의해 생성되므로 이형접합성으로 인한
작물의 균일성이 부족하다는 단점이 있다. 기본적으로, 각 종자는 유전자적으로 상이하고 각각 자신의 특이적 특색에
따라 성장한다. 따라서, 형질전환된 식물은 재생된 식물이 돌연변이 모식물과 동일한 특색과 특징을 갖도록 제조되어
야 하는 것이 바람직하다. 따라서, 형질전환된 식물은 이 식물의 일정한 고속 재생을 제공하는 미세번식에 의해 재생
되어야 하는 것이 바람직하다.
본 발명의 핵산 작제물내에 포함된 분리된 핵산을 일시적으로 발현시키는데 사용될 수 있는 일시 발현 방법으로는 전
술한 바와 같으나 일시 발현에 유리한 조건하에서의 미량주입법 및 충격법과, 핵산 작제물을 포함하는 포장 또는 비
포장된 재조합 바이러스 벡터가 식물 조직이나 세포를 감염시키는데 사용되어 그 내부에 형성된 번식성 재조합 바이
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러스가 비바이러스성 핵산 서열을 발현하게 되는 바이러스 매개 발현법이 있으나, 이것에 국한되는 것은 아니다.
식물 숙주를 형질전환시키는데 유용한 것으로 밝혀진 바이러스로는 CaMV, TMV 및 BV가 있다. 식물 바이러스를 사
용한 식물의 형질전환에 대해서는 문헌[미국 특허 제4,855,237호(BGV), EP-A 67,553(TMV), 일본 공개원 63-146
93(TMV), EPA 194,809(BV), EPA 278,667(BV); 및 Gluzman, Y. et al., Communications in Molecular Biology:
Viral Vectors, Cold Spring Harbor Laboratory, New York, pp.172-189(1988)]에 기술되어 있다. 식물을 비롯한
다양한 숙주에서 이종 DNA를 발현시키는데 사용되는 슈도바이러스 입자에 대해서는 WO 87/06261에 기술되어 있
다.
식물 내에 비바이러스성의 외인성 핵산 서열을 도입 및 발현시키기 위한 식물 RNA 바이러스의 작제는 전술한 문헌은
물론 문헌[Dawson, W.O. et al., Virology(1989) 172:285-292; Takamatsu et al. EMBO J.(1987) 6:307-311; Fr
ench et al. Science (1986) 231:1294-1297; 및 Takamatsu et al., FEBS Letters (1990) 269:73-76]에 제시되어
있다.
바이러스가 DNA 바이러스인 경우, 작제는 바이러스 자신에 의해 이루어질 수 있다. 대안적으로, 바이러스를 먼저 이
종 DNA를 가진 목적 바이러스 벡터를 용이하게 작제하기 위하여 박테리아 플라스미드 내로 클로닝할 수 있다. 그 다
음, 바이러스는 플라스미드로부터 절제될 수 있다. 바이러스가 DNA 바이러스인 경우에는, 박테리아 복제 오리진을
바이러스 DNA에 부착시킨 뒤 박테리아가 복제하도록 한다. 이 DNA의 전사 및 해독은 바이러스 DNA를 캡시드화하
는 외피 단백질을 생산할 것이다. 바이러스가 RNA 바이러스인 경우에는, 일반적으로 바이러스를 cDNA처럼 클로닝
하여 플라스미드에 삽입한다. 그 다음, 이 플라스미드를 사용하여 모든 작제물을 제조한다. 그 후, RNA 바이러스는
상기 플라스미드의 바이러스 서열을 전사시켜 제조하고, 이 바이러스 유전자의 해독으로 바이러스 RNA를 캡시드화
하는 외피 단백질을 생산한다.
본 발명의 작제물에 포함되는 것과 같은 비바이러스성의 외인성 핵산 서열을 식물 내에 도입시켜 발현시키기 위한 식
물 RNA 바이러스의 작제는 전술한 문헌은 물론 미국 특허 제5,316,931호에 예시되어 있다.
일 구체예에서, 천연 외피 단백질 암호 서열이 바이러스 핵산에서 결실되고, 식물 숙주내에서 발현할 수 있고 재좋바
식물 바이러스 핵산을 포장하여 재조합 식물 바이러스 핵산에 의해 숙주를 전신 감염시킬 수 있는 비천연의 식물 바
이러스 외피 단백질 암호 서열 및 비천연의 프로모터, 바람직하게는 비천연의 외피 단백질 암호 서열의 서브게놈성
프로모터를 삽입한 식물 바이러스 핵산이 제공된다. 대안적으로, 외피 단백질 유전자는 그 내에 단백질이 생성되도록
비천연의 핵산 서열을 삽입하여 불활성시킬 수 있다. 재조합 식물 바이러스 핵산은 1 이상의 추가 비천연 서브게놈성
프로모터를 포함할 수 있다. 비천연의 서브게놈성 프로모터는 각각 식물 숙주 내에서 인접 유전자 또는 핵산 서열을
전사 또는 발현시킬 수 있고, 서로 재조합하거나 천연의 서브게놈성 프로모터와 재조합할 수 없다. 비천연(이종) 핵산
서열은 핵산 서열이 1 이상 포함된다면 천연 식물 바이러스 서브게놈성 프로모터 또는 천연 및 비천연의 식물 바이러
스 서브게놈성 프로모터 부근에 삽입될 수 있다. 이 비천연의 핵산 서열은 목적 산물을 생성하기 위하여 서브게놈성
프로모터의 조절하에 숙주 식물내에서 전사 또는 발현된다.
제2 구체예에서, 재조합 식물 바이러스 핵산은 천연의 외피 단백질 암호 서열이 비천연의 외피 단백질 암호 서열 대
신에 비천연 외피 단백질 서브게놈성 프로모터 중 하나에 인접하게 배치되는 것을 제외하고는 제1 구체예에서와 같이
제공된다.
제3 구체예에서, 천연 외피 단백질 유전자가 그 서브게놈성 프로모터에 인접 배치되고 1 또는 그 이상의 비천연 서브
게놈성 프로모터가 바이러스 핵산에 삽입된 재조합 식물 바이러스 핵산이 제공된다. 여기에서 삽입된 비천연의 서브
게놈성 프로모터는 식물 숙주 내에서 인접 유전자를 전사 또는 발현시킬 수 있고 서로 재조합하거나 천연의 서브게놈
성 프로모터와 재조합할 수 없다. 비천연의 핵산 서열은 이 서열이 숙주 식물 내에서 상기 서브게놈성 프로모터의 조
절하에 전사 또는 발현되어 목적 산물을 생성하도록 비천연의 서브게놈성 식물 바이러스 프로모터에 인접하게 삽입
될 수 있다.
제4 구체예에서, 천연 외피 단백질 암호 서열이 비천연의 외피 단백질 암호 서열로 교체된 것을 제외하고는 제3 구체
예에서와 같은 재조합 식물 바이러스 핵산이 제공된다.
이 바이러스 벡터는 재조합 식물 바이러스 핵산에 의해 암호화된 외피 단백질에 의해 캡시드화되어 재조합 식물 바이
러스를 형성한다. 이 재조합 식물 바이러스 핵산 또는 재조합 식물 바이러스는 적당한 숙주 식물을 감염시키는데 사
용된다. 이 재조합 식물 바이러스 핵산은 숙주 내에서 복제하여 숙주 내에 전신 분포된 뒤, 숙주 내에서 이종 유전자(
분리된 핵산)를 전사 또는 발현시켜 목적 산물을 생성할 수 있다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드와 다른 폴리뉴클레오타이드의 공동형질전환은 본원에 완전히 참고인용되는 EP 제44
0,304 A1에 개시된 바와 같이 키티나제와 글루코나제의 배합과 같은 상승작용을 나타내어 바람직하다.
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본 발명의 핵산 작제물로 형질전환될 수 있는 식물 종으로는 일반적으로 농업, 원예, 임업, 정원가꾸기, 실내원예 또는
식품이나 사료로 직접 사용하거나 임의 종류의 산업에서 추가 가공하기 위한 식물, 물질 추출, 장식용, 번식, 교배 또
는 임의의 다른 용도의 식물을 포함하는 임의의 다른 활동 형태에 일반적으로 사용되는 겉씨식물과 속씨식물, 쌍자엽
식물과 단자엽식물의 종 등이 있다.
일반적으로, 형질전환 후 식물 세포 또는 외식편은 본 발명의 작제된 벡터에 의해 암호화된 1 이상의 마커의 존재를
통해 선택하고, 그 후 형질전환된 물질을 전 식물로 재생/번식시킨다. 식물 번식의 가장 일반적인 방법은 종자 이용법
이다. 하지만, 종자 번식에 의한 재생은 종자가 멘델 법칙에 의해 좌우되는 유전자 변수에 따라 식물에 의해 생성되므
로 이형접합성으로 인한 작물의 균일성이 부족하다는 단점이 있다. 기본적으로, 각 종자는 유전자적으로 상이하고 각
각 자신의 특이적 특색에 따라 성장한다. 따라서, 돌연변이 식물은 재생된 식물이 돌연변이 모식물과 동일한 특색과
특징을 갖도록 제조되어야 하는 것이 바람직하다. 따라서, 돌연변이 식물은 이 식물의 일정한 고속 재생을 제공하는
미세번식에 의해 재생되어야 하는 것이 바람직하다.
미세번식은 선발된 모식물 또는 변종으로부터 분리된 조직 단편으로부터 새로운 세대의 식물을 성장시키는 방법이다
. 이 방법에 의해 융합 단백질을 발현하는 바람직한 조직을 가진 식물의 대량 재생이 가능할 수 있다. 생성되는 신세대
식물은 원 식물과 유전자적으로 동일하고 모든 특성을 갖고 있다. 미세번식으로 인하여, 단기간에 우량 식물 물질을
대량 생산할 수 있고 본래의 돌연변이 또는 형질전환 식물의 특성이 보존되는 선발된 변종을 신속하게 번식시킬 수
있다.
미세번식은 단계 마다 배양 배지 또는 성장 조건의 변화를 필요로 하는 다단계 절차이다. 즉, 미세번식 과정은 4가지
기본 단계를 포함한다: 단계 1, 1차 조직 배양; 단계 2, 조직 배양 번식; 단계 3, 분화 및 식물 형성; 단계 4, 온실 배양
및 야냉육묘. 단계 1인 1차 조직 배양 동안 오염 없이 조직 배양물이 형성되고 보증된 다. 단계 2 동안 1차 조직 배양
물은 생산 목표를 만족시키기에 충분한 수의 조직 시료가 생산될 때까지 번식된다. 단계 3 동안, 단계 2에서 증식된
조직 시료는 분할되어 각각의 소식물체로 성장된다. 단계 4에서, 돌연변이 소식물체는 야냉육묘를 위해 온실로 옮겨
지고, 여기에서 빛에 대한 식물의 내성이 점차 증가되어 자연 환경에서 성장할 수 있게 된다.
식물 형질전환 및 번식 후, 적당한 식물은 외인성 엔도키티나제의 발현 수준을 모니터하거나 해당 mRNA의 전사 수
준을 모니터하여 선택할 수 있다.
외인성 엔도키티나제의 발현 수준은 재조합 폴리펩타이드를 특이적으로 인식하는 항체, 예컨대 서열번호 47의 시그
널 펩타이드의 N-말단 단부에 대하여 지향성인 항체를 사용하여 실시할 수 있는 면역검출법(즉, ELISA 및 웨스턴 블
롯 분석법, 면역조직화학법 등)을 사용하여 측정할 수 있다. 항체 생성 방법은 본원에 전체적으로 참고인용되는 문헌[
'Cellular and Molecular immunology' Abbas, K. et al.(1994) 2nd ed. WB Saunders Comp ed.]에 개시되어 있다.
대안적으로, 재조합 폴리펩타이드는 비제한적으로 쿠마시 블루 또는 은 염색과 같은 여러 염색 기법을 사용하는 SDS
-PAGE 분석으로 모니터할 수도 있다.
본 발명의 폴리펩타이드를 암호화하는 mRNA 수준은 또한 형질전환율 및/또는 수준의 지표일 수 있다. mRNA 수준
은 당업자에게 공지된 다양한 방법, 예컨대 특정 올리고뉴클레오타이드 프로브에 대한 하이브리드화(예, 노던 분석)
또는 PCR에 의해 측정될 수 있다.
이러한 폴리펩타이드는 전술한 폴리뉴클레오타이드 서열과 특이적으로 하이 브리드할 수 있는 적어도 17개, 적어도
18개, 적어도 19개, 적어도 20개, 적어도 22개, 적어도 25개, 적어도 30개 또는 적어도 40개 염기의 것이다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드 서열을 특이적으로 검출하기 위하여 사용된 하이브리드화 조건하에서 다른 관련 유전
자와 하이브리드하지 않는 특정 올리고뉴클레오타이드 프로브를 고안하는 방법이 취해져야 한다. 실시예 14는 특정
올리고뉴클레오타이드 고안에 유용할 수 있는 보존 서열을 예시한다.
짧은 핵산(길이가 200bp 이하, 예컨대 17개 내지 40개 bp)의 하이브리드화는 필요한 엄중도에 따라 다음과 같은 하
이브리드화 프로토콜을 사용하여 실시할 수 있다: (i) 6 x SSC와 1% SDS 또는 3M TMACI, 0.01M 인산나트륨(pH 6
.8), 1mM EDTA(pH 7.6), 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 0.1% 탈지분유로 이루어진 하이브리드화
용액, T m보다 1 내지 1.5℃ 이하인 하이브리드화 온도, T m보다 1 내지 1.5℃ 낮은 온도에서 3M TMACI, 0.01M
인산나트륨(pH 6.8), 1mM EDTA(pH 7.6), 0.5% SDS로 이루어진 최종 세척 용액; (ii) 6 x SSC와 1% SDS 또는 3M
TMACI, 0.01M 인산나트륨(pH 6.8), 1mM EDTA(pH 7.6), 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성된 연어 정자 DNA 및 0.1%
탈지분유로 이루어진 하이브리드화 용액, T m보다 2 내지 2.5℃ 낮은 하이브리드화 온도, T m보다 1 내지 1.5℃
이하에서 3M TMACI, 0.01M 인산나트륨(pH 6.8), 1mM EDTA(pH 7.6), 0.5% SDS로 이루어진 최종 세척 용액, 최
종 세척 용액 6xSSC, 22℃에서의 최종 세척; (iii) 6 x SSC와 1% SDS 또는 3M TMACI, 0.01M 인산나트륨(pH 6.8),
1mM EDTA(pH 7.6), 0.5% SDS, 100㎍/ml 변성된 연어 정 자 DNA 및 0.1% 탈지분유로 이루어진 하이브리드화 용
액, 37℃의 하이브리드화 온도, 최종 세척 용액 6 x SSC를 이용한 22℃에서의 최종 세척.
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본 발명의 올리고뉴클레오타이드는 차감 하이브리드화, 차등 플라크 하이브리드화, 친화성 크로마토그래피, 전기분사
질량 분광분석법, 노던 블롯, RT-PCR 등을 비롯한 뉴클레오타이드 하이브리드화에 근거한 모든 기법으로 사용될 수
있다. PCR을 기본으로 한 방법인 경우, 한쌍의 올리고뉴클레오타이드는 대향 배향으로 사용되어 폴리머라제 연쇄 반
응과 같은 핵산 증폭 반응에서 그 일부분이 직접 지수적으로 증폭될 수 있도록 한다. 이러한 양태의 본 발명에 따른
올리고뉴클레오타이드 쌍은 융점(T m)이 상용성인, 예컨대 융점이 7℃ 미만, 바람직하게는 5℃ 미만, 보다 바람직하
게는 4℃ 미만, 가장 바람직하게는 3℃ 미만, 이상적으로 3℃ 내지 0℃ 사이의 차이를 보이는 것으로 선택하는 것이
바람직하다.
이러한 양태의 본 발명에 따른 신균 키티나제를 단독으로 또는 본 발명의 재조합 키티나제와 상승작용하는 다른 유전
자 암호 단백질(전술함)과 함께 생산하거나 과잉생산하는 식물 및 식물 부분은 병원균 저항성, 구체적으로 진균 저항
성을 평가하는데 사용할 수 있다. 그 다음, 육종 프로그램으로 보다 저항성인 식물주를 사용하여 병원균 저항성, 특히
진균 저항성이 향상된 상업적 변종을 수득할 수 있다. 병원균이나 진균 공격에 대하여 감수성이 감소된 식물은 포장
이나 온실에서 사용된 뒤, 동물 사료로, 인간의 직접 소비용으로, 장기간 저장용으로 사용되거나 식물이나 기타 산업
적 가공 등에 사용될 수 있다. 본 발명에 따른 이 식물 또는 이의 부분의 장점은 제균제 처리의 필요성이 감소되어 물
질의 비용, 노동비 및 환경 오염을 줄이거나 제품(예, 과실, 종자 등)의 저장수명을 연장시킬 수 있다는 점이다. 또한,
수확한 식물이나 식물 조직에 의해 발현되는 키티나제의 존재로 인하여 수확후 손실이 감소될 수도 있다.
또한, 본 방법론은 냉해로부터 식물을 보호하는데 사용할 수 있다. 키티나제는 또한 키틴을 가용성 당 단위(예, N-아
세틸-글루코사민 단량체 또는 이의 올리고머)로 분해하는 것으로 알려져 있다[Roberts et al.(1988) J.Gen.Microbio
l.134, 169-176]. 작은 가용성 화합물, 특히 당은 냉해 또는 동해에 대한 보호작용에 관여하거나 보호작용을 일으키
는 것으로 알려져 있다[Finkle, B.J. et al.(1985) Cryopreservation of Plant Cells and Organs(Chapter 5), Pages
75-113, CRC Press, Inc. Boca Raton, Fla.: Sakai, et al.(1968) Cryobiol. 5(3):160-174]. 따라서, 냉해 보호작용
은 식물 다당류(예, 헤미셀룰로스 및 펙틴과 같은 세포벽의 다당류 성분의 베타-1,4-글리코사이드 결합의 절단)를 분
해하여 동해나 냉해에 대한 보호작용을 증가시킬 수 있는 가용성 당의 수준을 증가시키는 본 발명의 키티나제에 의해
매개될 수 있는 것으로 사료된다.
즉, 본 발명의 또 다른 양태에 따르면, 냉해에 대한 식물의 감수성을 감소시키는 방법이 제공된다.
이 방법은 전술한 바와 같은 본 발명의 폴리뉴클레오타이드로 식물을 형질전환시키는 단계 및 이 형질전환 식물을 냉
온(0 내지 10℃) 또는 동결 온도(0℃ 이하) 하의 포장 조건에서 성장시키는 단계 및 그 다음 감소된 냉해 또는 동해를
보 이거나 그렇지 않다면 냉해 또는 동해에 대한 저항성 또는 증가된 저항성을 보이는 식물(또는 이의 과실)을 선택하
는 것을 포함한다(모두 전체적으로 본원에 참고인용되는 미국 특허 제6,235,683호, 제5,776,448호, 제5,633,450호
및 제5,554,524호 참조).
이 방법은 냉해(즉, 동결이나 냉각)가 방지되는 식물 생산에 사용할 수 있다.
본 발명의 형질전환 식물에 포함된 가용성 당의 수준이 향상된다면 본 발명의 방법은 당 함량이 보다 높은 과실을 생
산하는 식물 생산에 사용할 수 있다. 이와 같은 경우에 외인성 키티나제 암호화 폴리뉴클레오타이드는 당함량의 증가
가 요구되는 식물 부분(예, 과실)에서 발현되는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법은 저장, 보존 및 저장 수명성의 개선을 비롯하여 당 함량 감소 또는 촉진된 당 함량 감소를 나타내는
식물에 다른 성질을 부여하는데 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 추가적인 관련 용도를 가질 수 있다. 본 발명의 키티나제는 의약용으로 주사되거나 이식된 키틴계 구
조물을 분해시키는 기구로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 약물은 키틴계 캅셀('키토좀')에 첨가될 수 있다. 이 캅셀에
본 발명의 키티나제를 소정량 동시 첨가하면 약물을 조절 방출시킬 수 있다. 특히 약물이 키틴 기질에 포획되어 있다
면 느리지만 점차적으로 약물을 방출시킬 수 있다. 이러한 시스템에 대한 키티나제 효소의 사용은 키틴계 캅셀을 최
종적으로 파괴하면서 면역반응을 일으키지 않을 수 있다. 이러한 시스템에 사용된 약물은 효소 및 유 전자 요법의 목
적에 따라 소 화합물에서부터 단백질 및 DNA 단편에 이르기까지 다양할 수 있다.
또 다른 관련 용도는 구조 성분으로서 키틴을 함유하는 이식편을 신속 분해하는데 사용되는 본 발명의 키티나제, 바
람직하게는 재조합 형태의 용도이다. 이 용도는 일시적으로 기능을 수행해야만 하고 재조합 키티나제를 투여함으로써
편리하게 '용해'될 수 있는 이식편인 경우에 유용할 것이다.
본 발명의 또 다른 목적, 장점 및 신규 특징은 당업자라면 제한의 목적이 아닌 이하의 실시예를 검토함으로써 명확히
알 수 있을 것이다. 또한, 전술하고 이하 청구의 범위에서 청구한 바와 같은 본 발명의 다양한 구체예 및 양태는 각각
이하 실시예의 실험을 통해 지지되고 있다.
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실시예
전술한 상세한 설명과 함께 이하의 실시예는 본 발명의 비제한적 방식으로 예시하기 위한 것이다.
일반적으로 본 명세서에 사용된 용어와 본 발명에 사용된 실험 절차는 분자생물학, 생화학, 미생물학 및 재조합 DNA
기법을 포함한다. 이러한 기법은 문헌에 충분히 설명되어 있다. 예를 들면 다음을 참조할 수 있다: 'Molecular Clonin
g: A laboratory Manual' Sambrook et al.(1989); 'Current Protocols in Molecular Biology' Volumes I-III Ausub
el,R.M., ed.(1994); Ausubel et al., 'Current Protocols in Molecular Biology', John Wiley and Sons, Baltimore,
Maryland(1989); Perbal, 'A Practical Guide to Molecular Cloning', John Wiley amp; Sons, New York (1988);
Watson et al., 'Recombinant DNA', Scientific American Books, New York; Birren et al.(eds) 'Genomic Analysi
s: A Laboratory Manual Series', Vols. 1-4, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York(1998); 미국 특허
제4,666,828호, 제4,683,202호, 제4,801,531호, 제5,192,659호 및 제5,272,057호에 기술된 바와 같은 방법론; 'Cel
l Biology: A Laboratory Handbook', Volumes I-III Cellis,J.E., ed.(1994); 'Current Protocols in Immunology' V
olumes I-III Coligan J.E., ed.(1994); Stites et al.(eds), 'Basic and Clinical Immunology'(8th Edition), Appleton
amp; Lange, Norwalk, CT(1994); Mishell and Shiigi(eds), 'Selected Methods in Cellular Immunology', W.H. F
reeman and Co., New York(1980); 이용가능한 면역분석법은 다음과 같은 특허 및 과학 문헌에 광범위하게 기술되
어 있다, 예컨대 미국 특허 제3,791,932호; 제3,839,153호; 제3,850,752호; 제3,850,578호; 제3,753,987호; 제3,86
7,517호; 제3,879,517호; 제3,879,262호; 제3,901,654호; 제3,935,074호; 제3,984,533호; 제3,996,345호; 제4,03
4,074호; 제4,098,876호; 제4,879,219호; 제5,011,771호; 및 제5,281,521호; 'Oligonucleotide Synthesis' Gait,M.
J., ed.(1984); 'Nucleic Acid Hybridization' Hames,B.D., and Higgins,S.J.,eds. (1985); 'Transcription and Trans
lation' Hames,B.D., and Higgins, S.J.,eds. (1984); 'Animal Cell Culture' Freshney,R.I., ed.(1986); 'Immobilized
Cells and Enzymes' IRL Press,(1986); 'A Practical Guide to Molecular Cloning' Perbal, B.,(1984) and 'Method
s in Enzymology' Vol.1-317, Academic Press; 'PCR Protocols: A Guide To Methods And Applications', Acad
emic Press, San Diego, CA(1990); Marshak et al., 'Strategies for Protein Purification and Characterization-
A Laboratory Course Manual' CSHL Press(1996); 이 문헌들은 모두 전체적으로 본원에 기재된 바와 같이 참고인
용된다. 이 명세서를 통해 다른 일반 문헌들도 제시한다. 본 명세서에 제시된 절차는 당해 기술분야에 공지된 것으로
서, 독자의 편의를 위해 제시하였다. 여기에 포함된 모든 정보는 본 명세서에도 참고인용된다.
일반 재료 및 방법
식물 물질:포충엽 식물(네펜테스 카시아나)을 온실(25℃)에서 비료없이 성장시키고 2차 증류수를 공급하였다. 멸균
성을 보존하기 위하여 멸균 주사기로 폐쇄 트랩으로부터 트랩 수프를 채취하여 일정량씩 -70℃에 보관하였다. 트랩
및 잎 조직이 사용되는 경우에, 이 조직들은 다음과 같이 준비하였다: 잎 또는 트랩 조직을 갓 측정한 중량 1g 당 각각
2ml 또는 5ml 추출 완충액(0.125M Tris-HCl, pH 7.0 및 20% 글리세롤)에서 파쇄하였다. 파쇄액을 에펜도르프 미
니원심분리기에서 14,000 rpm으로 5분 동안 원심분리하고 상청액을 사용하여 SDS-PAGE 및 키티나제 활성 겔 분
석하였다.
키티나제 활성 겔:키티나제 활성은 잎, 트랩 조직 또는 멸균 트랩 수프로부터 제조한 추출물을 천연 12% 아크릴아마
이드 겔 상에서 분리시킨 뒤, 기질로서 키틴-글리콜(0.01% w/v)을 함유하는 제2 아크릴아마이드 겔과 중층시키고 3
7℃에서 8시간 동안 항온처리하여 조사하였다. 키티나제 활성은 0.01%(w/v) 칼코플루오르 백 색 M2R로 5분동안 염
색한 후 UV 광(260nm)하에 가시화하여 겔 상의 어두운 반점으로 확인하였다.
웨스턴 분석:SDS-PAGE는 12 또는 15% 분리 겔과 5% 적층 겔로 실시하였다. 단백질을 PVDF 막(Gelman)으로 전
이시킨 뒤, 세라티아 마르세슨스 키티나제(ChiAII)(Jones et al., 1986)에 대한 토끼 폴리클론 항체 또는 쥐 항-HA
항체(식물의 돌연변이 발현시)[Rat monoclonal antibody(clone 3F10), Roch, Cat.No.1867423]를 사용하여 검출한
뒤, 각각 알칼리성 포스파타제 접합된 친화성 정제된 염소 항토끼 또는 항쥐 IgG(Affinipure Goat-anti-Rat, Jackso
n Immunoresearch Cat.No., 112-055-003)로 가시화하였다.
SDS-PAGE 겔의 복원: 머캅토에탄올을 사용하거나 사용하지 않은 일반 SDS-PAGE 후 겔을 40mM 트리스-HCl, p
H 8.8, 1% 카세인, 2mM EDTA에서 20분 동안 항온처리하여 복원시켰다. 그 다음, 겔을 0.01%(w/v) 글리콜 키틴을
함유하는 7.5% 아크릴아마이드 키티나제 활성 겔과 중층시키고 전술한 바와 같이 키티나제 활성을 모니터하였다.
엑소키티나제 및 키토바이오시다제 활성:트랩 및 잎 조직 추출물 뿐만 아니라 수프에 대하여 기질로서 p-니트로페닐
N-아세틸-D-글루코사민(이량체, Sigma) 또는 p-니트로페닐-D-N,N-디아세틸 키토바이오스(삼량체, Sigma)를 사
용하여 엑쇠티나제 및 키틴 1,4-키토바이오시다제 활성에 대해 시험하였다. 키티나제 활성은 pH6.5에서 상기 기질의
가수분해로부터 생성되는 니트로페놀의 흡광도를 410nm에서 분광광도계로 측정하여 검출하였다.
FPLC 분석:트랩 수프를 탈염시키고 세파덱스 G-25 상에서의 겔 여과로 pH 10으로 조정하였다. 그 다음, 모노 Q 음
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이온 교환 컬럼 상에 장입하고 NaCl 농도를 증가시키면서 컬럼으로부터 결합된 키티나제를 용출시켰다. 각 분획(1 m
l) 내의 단백질 함량은 280nm에서의 흡광도에 따라 평가되었다.
키틴 주입에 의한 키티나제 활성 유도:pH 5.0인 콜로이드성 키틴(1mg/100㎕)을 폐쇄 트랩 내로 멸균 주사기를 이용
하여 주입하였다. 주입 후 일정 간격마다 이 폐쇄 트랩으로부터 수프를 일정량씩 채취하였다.
게놈 DNA의 분리:DNA 추출 완충액(0.35M 소르비톨; 0.1M 트리스-HCl, pH 7.5; 5mM EDTA 및 0.02M 아황산수
소나트륨) 1 부피, 핵 용해 완충액(0.2M 트리스-HCl, pH 7.5; 50mM EDTA; 2M NaCl 및 2% CTAB) 1 부피 및 5%
사코실 0.4 부피를 함유하는 완충액 5ml에서 잎 조직(1g)을 파쇄하였다. 파쇄물을 65℃에서 20분 동안 항온처리한
뒤 클로로포름:이소아밀 알코올(24:1) 1부피로 2회 추출하였다. 수성 상에 6N NaI 3 부피를 첨가하고, 고순도 플라
스미드 분리 키트(Boehringer Mannheim)의 고순도 필터 튜브를 사용하여 게놈 DNA를 세정 분리하였다.
총 RNA의 분리:총 RNA는 포충엽(트랩)의 하단부에서 특정 고온 붕산염/단백분해효소 K 방법(Schulze et al., 1999
)을 사용하여 분리하였다.
mRNA의 분리:폴리아데닐화된 mRNA는 올리고 dT를 접합시킨 자기 DynaBeads(Dynal, Norway)를 사용하여 총
RNA로부터 분리하였다.
축퇴성 역 PCR 및 유전자 특이적 프라이머:그룹 1 염기성 키티나제, 그룹 2 염기성 키티나제 및 산성 키티나제 각각
에 대하여 특이적으로 고안된 3 세트의 축퇴성 프라이머(#1-3)를 사용하여 각 키티나제 유전자의 부분 서열을 1차 P
CR 증폭시켰다(표 I).
[표 I]
그룹 1 염기성, 그룹 2 염기성 및 산성 키티나제 유전자 부분 서열을 증폭시키기 위해 고안한 축퇴성 프라이머
d-순방향
r-역방향
프라이머 #4-6은 그룹 2에 속하는 염기성 키티나제 유전자에 대해 사용된 역 PCR 기법에 이용하였다 (표 II).
[표 II]
역 PCR 기법으로 그룹 2 염기성 키티나제를 분리하기 위해 고안한 프라이머
프라이머 #7-9는 트랩 분비 세포에 존재하는 전사된 유전자를 동정하기 위한 유전자 특이적 프라이머로서 사용하고
프라이머 #10-11(유전자-특이적)은 전장 cDNA를 분리하는데 사용하였다(표 III).
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[표 III]
전사된 유전자의 동정 및 전장의 cDNA를 분리하기 위해 고안된 유전자 특이적 프라이머
프라이머 12 내지 13은 HA 암호 서열을 가진 플라스미드 내로 분리된 유전자를 클로닝할 수 있는, 직접 PCR 전략에
의한 유전자 분리에 사용하기 위해 특이적으로 고안된 프라이머이다.(표 IV)
[표 IV]
직접 PCR 전략으로 유전자를 분리하는데 사용되는 유전자 특이적 프라이머( 분리된 유전자를 HA 암호 서열을 가진
플라스미드 내로 클로닝할 수 있음)
진균 활성:시험관내 감수성 시험에는 국립 임상 실험 표준 위원회(NCCLS)가 추천한 배양액 미량희석 방법 NCCLS
M27-P를 사용하였다[Espinel-Ingroff amp; Pfaller, 1995; ASM Manual of Clinical Microbiology]. 미량희석 기
법은 조사 시료의 연속 희석물을 함유하는 성장 배지에서 효모를 배양하기 위해 96웰 미량역가 평판을 사용한다. 성
장 속도는 530nm에서의 흡광도를 측정하여 모니터하였다. 효모 시험 균주로서 C.알비칸스 분리주 CBS562(네덜란
드 델프트에 소재하는 쉼멜 배양물 수집소에서 수득한 것임)를 사용하였다. 칸디다 종의 최소 억제 농도(MIC)는 <1
내지 1㎍/ml 범위를 사용하였다(Espinel-Ingroff et al. 1997, J.Clin.Microbiol. 35:139). 최종 진균 시험 조건은 다
음과 같다: 편평한 바닥의 미량역가 평판(Nunc)의 96웰 각각에 시험 배지(1% 글루코스와 0.15% 아스파라긴이 보충
된 효모 질소 기제 배지)에 용해된 약물(식물 물질 또는 AMB) 0.1ml 및 효모 추출물(0.5 내지 2.5 x 10 3 세포/웰) 0.
1ml을 첨가하엿다. 처음 10개의 웰에는 연속 2배 희석율의 약물과 동일한 초기수의 효모 세포를 첨가하고; 웰 11에
는 진균 대조군(약물 무첨가)을 첨가하고 웰 12에는 배지 대조군(약물, 진균 모두 무첨가)을 첨가하였다. 28℃에서 4
8시간 동안 항온배양한 후 530nm에서의 흡광도를 미량역가 판독기로 측정하였다. 최소 억제 농도(MIC) 값은 C.알비
칸스 번식을 완전히 억제하는 약물의 최소 농도로서 정의되어진다. 또한, 약물 처리 말기의 세포 100㎕를 약물을 첨
가하지 않은 고체 배지(Sabuaruad) 상에 재도말하고 28℃에서 48시간 동안 항온배양한 후 콜로니 수를 계수하여 효
모 사멸성을 재확인하였다(최소 진균 농도).
키티나제 활성 분석(광학 흡광도):이 분석은 트론스모와 하만(Tronsmo and Harman (1993) Anal. Biochem. 208:7
4-79)의 절차에 따라 실시하였다. 시험 시료를 미량역가 평판의 편평한 웰에 첨가하였다. 50mM 인산칼륨 완충액(p
H 6.7)에 용해시킨 기질 용액의 증가량(0 내지 15㎍)을 첨가하였다. 이 평판을 50℃에서 30분 동안 항온배양하였다.
각 웰에, 기질의 효소 절단에 의해 형성된 p-니트로페놀의 색을 증강시키는 작용을 하기도 하는 0.4M Na 2 CO 3 50
㎕를 첨가하여 반응을 종결시켰다. 405nm에서의 흡광도를 미량평판 판독기로 측정하였다.
은 염색:이 분석은 블룸(Blum H et al.(1987) Electrophoresis 8:93-99)의 방법에 따라 실시하였다.
질량 분광분석법:이 분석은 쉐브첸코 에이 등(Shevchenko A et al.(1996) Anal. Chem. 68:850-858)의 방법에 따
라 실시하였다.
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실시예 1
여러 네펜테스 종의 신규 키티나제
식충성 식물 네펜테스 카시아나(Nepenthes kassiana)는 먹이를 유인하여 포획하는 수동적 방법을 사용하는 포충
엽 식물이다(Owen and Lennon, 1999). 트랩은 변형된 표피낭상엽성(epiascidiate) 잎으로서, 향축면이 둥글게 말려
서 융합하여 포충엽관의 내벽을 형성하고 있다. 곤충이 포충엽의 가파른 경사 벽에서 미끌어져 떨어질 때 기저부에
있는 포충엽의 하부샘영역에서 분비된, 분비 세포에 풍부한 단백분해 효소를 포함하는 것으로 보고된(Owen and Len
non, 1999) 유액(수프)에 포획된다. 네펜테스 카시아나의 여러 조직에 존재하는 키티나제를 특성규명하기 위하여 멸
균 포충엽 유액(수프), 잎 조직 및 포충엽(트랩) 조직 유래의 키티나제들의 이동성을 천연 폴리아크릴아마이드 겔 상
에서 연구하였다. 전기영동 후 겔을, 기질로서 키틴-글리콜(0.01% w/v)을 함유하는 제2의 키티나제 활성 겔과 중층
시켰다. 키티나제 활성은 37℃에서 하룻밤동안 항온처리한 후 키틴분해 활성을 나타내는 겔 상의 어두운 반점으로서
가시화되었다. 농축된 잎 추출물, 폐쇄 또는 개방 트랩 유래의 트랩 조직 추출물(각각 150㎕) 및 트랩 수프(75㎕) 중
에 존재하는 키티나제 활성을 나타내는 일반적인 키티나제 활성 겔을 도 1에 제시한다. 놀라운 것은, 3가지 조직 추출
물 모두에서 키티나제 활성이 분명하게 나타난다는 것이다. 또한, 수프의 효소는 잎과 트랩 조직에 존재하는 효소와
상대적 이동성에 분명한 차이를 보였다.
실시예 2
공지의 키티나제 항원성 에피토프가 부족한 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제
다양한 조직에서 추출한 네펜테스 키티나제의 항원성의 차이를 밝히기 위하여 웨스턴 블롯 분석을 실시하여 세라티
아 마르세슨스 키티나제(ChiAII)에 대한 폴리클론 항체로 탐침하였다. 도 2a는 트랩(C) 또는 잎 조직(L) 추출물(50㎕)
과 트랩 수프(S)(40㎕)의 농축물을 장입시킨 15% SDS-PAGE 겔의 웨스턴 블롯을 나타낸다. 항-세라티아 ChiAII 항
체는 트랩 및 잎 조직의 키티나제는 인식하였지만(하부 화살표로 표시), 수프 키티나제는 인식하지 못하였다. 도 2b의
겔로부터 트랩 수프 키티나제와 잎(L) 또는 트랩 조직 키티나제 사이의 항원 동일성이 없음을 알 수 있고, 이는 트랩
수프 시료(S)의 단백질 농도를 초기 트랩 수프 부피 875㎕인 22배로 농축시킨 경우에도 면역 인식을 일으키지 못할
것임을 입증한다.
실시예 3
네펜테스 키티나제는 엔도키티나제이다.
엔도키티나제는 중합체 내에서 키틴을 분해한다. 이에 반해, 엑소키티나제 분해는 말단 분해에만 한정된다. 네펜테스
키티나제의 엔도키티나제 대 엑소키티나제 활성을 다음과 같이 평가하였다: 트랩 및 잎 조직 추출물 뿐만 아니라 수
프를, 기질로서 각각 p-니트로페닐 N-아세틸-D 글루코사민(이량체) 또는 p-니트로페닐-D-N,N-디아세틸 키토바
이오스(삼량체)를 사용하여 엑소키티나제 및 키틴 1,4-키토바이오시다제 활성에 대해 시험하였다. 키티나제 활성 검
출은 pH 6.5에서 상기 기질의 가수분해로부터 생성되는 니트로페놀 흡광도를 측정하여 410nm에서 분광분석법으로
실시하였다. 네펜테스 키티나제는 모두 엑소키티나제 또는 키토바이오시다제 활성을 전혀 나타내지 않는 반면, 세라
티아 ChiAII 키티나제는 키토바이오시다제 활성을 나타냈다. 수프, 트랩 및 잎 네펜테스 키티나제는 모두 글리콜-키
틴을 가수분해하였고(도 1), 이는 이 3가지 키티나제 모두 엔도키티나제임을 시사한다.
실시예 4
신규 네펜테스 수프, 트랩 및 잎 조직 키티나제 활성은 부분 변성에 저항적이다.
트랩 및 잎 조직의 추출물과 트랩 수프(비등 없이)를 2-머캅토에탄올이 무첨가된 15% SDS-PAGE 상에 장입하였다.
전기영동 후 겔을 40mM 트리스-HCl, pH 8.8, 1% 카세인, 2mM EDTA 중에서 항온처리하여 복원시키고 0.01% (w/
v) 글리콜 키틴을 함유하는 키티나제 활성 겔과 중층시켰다. 도 3은 전기영동 단계 동안 SDS의 존재로 일어나는 반변
성이 분리 후 SDS를 세척했을 때 수프(S), 트랩(C) 또는 잎(L) 조직의 키티나제 활성을 억제하지 않음을 나타내고 있
다. 이전에 비변성 천연 겔에서 확인한 바와 같이(도 1), 반변성 겔에서의 수프 키티나제의 이동 속도는 잎 및 트랩 조
직 키티나제의 이동 속도와 차이가 있다.
실시예 5
SDS 및 2-머캅토에탄올에 의해 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제 활성은 변성되지만 잎 효소의 활성은 변성되지
않는다.
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네펜테스 키티나제 사이의 또 다른 차이를 밝히기 위하여, 수프 및 잎 추출물을 비등(5분)한 시료와 비등하지 않은 시
료를 SDS와 2-머캅토에탄올의 존재하에 15% SDS-PAGE 상에서 분리하였다. 이 겔을 그 다음 실시예 4에 기술된
바와 같이 복원시키고 키티나제 활성 겔과 중층시켰다. 도 4a 및 도 4b는 SDS 외에 환원제인 2-머캅토에탄올의 첨가
가 수프 키티나제는 완전히 불활성화시키지만 잎 키티나제 활성에는 영향을 미치지 않는다는 것을 분명하게 입증하
고 있다. 이에 반해, 세라티아 키티나제 활성은 비등 시료에서만 불활성화되었다. 즉, 신규 수프 키티나제는 잎의 키티
나제와 분명하게 상이하다. 또한, 트랩 수프 키티나제 활성에 미치는 본래 S-S 결합의 중요성은 트랩 수프 키티나제
가 사슬간 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 이량체임을 시사한다(또한 도 1과 3에 제시된 겔에서의 상대적 이동을
통해서도 입증됨). 지금까지 동정된 식물 키티나제의 대부분의 활성 형태는 약 25 내지 40kDa의 단량체이다. 따라서
이량체 키티나제의 동정은 극히 드물고 예기치 못한 것이다.
실시예 6
비활성이 높은 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제
수프 키티나제는 SDS-PAGE의 쿠마시 염색으로 검출할 수 없다:키티나제 활성 겔(도 1) 상에 장입된 트랩 수프 시
료(75㎕)에 존재하는 단백질의 양은 브래드포드 분석의 검출 농도 이하이므로, 트랩 수프 600㎕를 농축시키고 크기
마커 및 과잉발현된 세라티아 ChiAII(Mr 58kDa) 함유 대장균 단백질 추출물(4㎍) 20㎕와 함께 15% SDS-PAGE 상
에서 분리하였다. 단백질 밴드는 쿠마시 브릴리언트 블루로 염색하여 가시화하였다. 활성 겔(도 1) 보다 쿠마시 염색
겔에 8배 이상의 트랩 수프를 적용했지만 단백질 밴드는 전혀 검출되지 않았다(도 5, 레인 S). 따라서, 수프 키티나제
는 비활성이 매우 높다는 것을 알 수 있다.
FPLC에 의한 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제의 농축/정제:도 1과 도 5에서 나타나는 결과에 따라 트랩 수프 키
티나제는 매우 높은 비활성을 갖고 있다. 트랩 수프 효소를 정제 및 농축하기 위하여 모노 Q 음이온 교환 컬럼을 사용
하여 FPLC 분리를 실시하였다. 수프(4ml)를 먼저 탈염시키고 세파덱스 G-25 상에서 겔 여과하여 pH 10으로 조정하
였다. 그 다음, 상기 음이온 교환 컬럼 상에 장입하고 결합된 키티나제는 농도 증가되는 NaCl로 컬럼을 세척하여 용출
시켰다. 각 분획(1ml)을 활성 겔 상에서의 키티나제 활성에 대하여 시험하였다. 도 6은 FPLC 분리의 일반적 예를 나
타낸 것이다. 각 분획에 존재하는 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도에 따라 측정되었다. 놀랍게도, 키티나제 활성
이 대부분의 OD 280함유 분획의 용출 보다 먼저 분획 7 내지 14(수직 화살표로 표시)에서 검출되었고, 이는 수프 유
래의 주 용출 FPLC 단백질 피크가 키티나제가 아님을 암시한다. 키티나제 활성이 0.2M NaCl에서 용출도니 분획에서
이미 검출될 수 있다는 사실은 이 단백질이 비교적 높은 pI 값을 갖고 있다는 것을 암시한다. FPLC 분석의 해상능을
높히기 위하여, 용출된 분획(다른 FPLC 분리에 의해)을 SDS-PAGE로 분석하고 은염색하였다(쿠마시 염색 보다 상
당히 더 민감함). 도 7은 키티나제 함유 분획(레인 9 내지 17)에서 검출된 2개의 주요 단백질 밴드도 다른 모든 분획
에서 유사하게 검출되는 것으로서, 키티나제 활성과 상관없는 것임을 명백히 나타내고 있다. 이 역시 신규 네펜테스
수프 키티나제가 매우 높은 비활성을 갖고 있음을 입증한다.
실시예 7
키틴은 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제를 유도한다.
유도된 키티나제 활성:도 6과 7은 정상적인 식물 성장 조건하에서 생성되어 폐쇄 트랩액으로 분비되는 키티나제 단
백질 양이 매우 적어서 키티나제 활성을 나타내는 단백질의 분리가 어렵다는 것을 명확히 나타내고 있다. 결론적으로,
키티나 제 양을 증가시키기 위한 시도로서 폐쇄 트랩 내로 키틴을 주입하였다. pH 5.0의 콜로이드성 키틴 약 1mg을
폐쇄 트랩 내로 주입하였다. 주입 전, 주입 후 20시간째 및 주입 후 5일째 트랩 수프에 존재하는 키티나제 활성을 측
정하였다. 놀랍게도, 주입된 키틴은 비유도된 키티나제와 천연 겔 상에서 다르게 이동하는 적어도 3종의 신규 키티나
제를 유도한 것으로 나타났다(도 8, 레인 4 및 5).
실시예 8
키틴으로 유도된 신규 네펜테스 수프 키티나제 활성에 해당하는 단백질의 동정
키틴 주입 전과 주입 후 여러 시점에서의 수프 시료를 12% SDS-PAGE로 분리하고 은 염색으로 가시화하였다. 키틴
주입은 적어도 4종의 신규 밴드의 출현을 유도하고 비유도 밴드 2개를 진하게 하였으며(도 9, 레인 2 내지 4), 이는
수프 키티나제가 구성성이며 유도성임을 시사한다. 이하에 보고되는 여러 키티나제 cDNA 뉴클레오타이드 서열(비유
도 조건 및 유도 조건하의)의 분리로, 아미노산 서열과 이들 각각의 MW가 예측될 수 있다. 5개의 고유 트랩 수프 단
백질 밴드를 SDS-PAGE 겔로부터 잘라내어 질량 분광분석적 서열분석을 위해 처리하였다.
실시예 9
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트랩 수프의 항진균 활성
키티나제는 키틴 함유 진균 세포벽을 가수분해함으로써 식물 방어 반응에서 주요 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
이 가수분해 활성은 진균 성장을 지연시키고 식물 조직 내로의 병원균의 침입을 예방하거나 연장시킨다. 네펜테스 트
랩 수프 의 항진균 활성은 3가지 시험관내 생물검정법으로 조사하였다.
키틴 유도성 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제는 인간 병원균 칸디다 알비칸스의 시험관내 성장을 억제한다: 주요
인간 병원균인 C. 알비칸스에 대한 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제의 항진균 효과를 측정하기 위하여, 정상 트랩
및 키틴 유도 트랩으로부터 멸균성 네펜테스 카시아나 트랩 수프를 채취하여 농축시켰다. 비교용으로서, 3종의 다른
식충성 식물(디오네아, 드로세라 및 사라세니아)의 잎 추출물을 프로테아제 억제제의 존재하에 제조하였다. 여러 추
출물 시료의 항진균 사멸/억제 활성은 방법 란에 상세히 기술된 바와 같이 칸디다 알비칸스 성장 분석을 사용하여 시
험관내에서 평가하였다. 그 결과는 각 시료의 최소 억제 농도(MIC)로 나타내어 표 V에 제시하였다.
[표 V]
식충성 식물 유래의 트랩 수프에 의한 칸디다 알비칸스 성장 억제
시험 시료 총 단백질 농도 키틴 유도 MIC (원 시료 희석율)
네펜테스 종 분비 추출물 1.2 mg/ml - 미검출
네펜테스 종 분비 추출물 3.1 mg/ml 1/8
네펜테스 종 분비 추출물 키틴 3.1 mg/ml 1/2
디오네아 종 분비 추출물 19.8 mg/ml - 1/32 *
드로세라 종 분비 추출물 8.4 mg/ml - 1/32 *
사라세니아 종 분비 추출물 16.4 mg/ml - 1/2
세라티아 마르세슨스 재조합체 2 유닛/ml - 미검출
* 실험에 사용된 최대 시료 희석율
이 결과는 칸디다 알비칸스 성장 억제에 정상 트랩 수프는 어떤 영향도 미치지 않는 반면, 키틴 유도성 트랩 수프는
매우 효과적인 영향(1/8 희석율의 시료)을 미친다는 것을 나타내고 있다. 분석 시료 중에 주입된 키틴이 존재할 때에
도 MIC는 증가하였다. 이것은 키티나제가 실제 항진균 활성에 중요한 역할을 한다는 것을 시사한다. 또한, 키틴 유도
성 수프에 대한 최소 제균 농도(MFC)를 측정하였을 때 MFC는 시료의 1/4 희석물인 것으로 관찰되었으며(도 10a),
이것은 이 농도에서 C. 알비칸스가 충분히 붕괴된다는 것을 시사한다. 또한, 시판용 세라티아 마르세슨스 키티나제는
억제 효과를 전혀 나타내지 않는 반면, 추가 3종의 식충성 식물의 잎 추출물은 칸디다 알비칸스 성장을 매우 강력하게
억제하였다(표 V, 도 24 참조).
실시예 10
키틴 유도성 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제는 셉토리아 트리티시의 성장을 억제한다.
식물 병원균인 셉토리아 트리티시의 성장에 미치는 키틴 유도성 수프의 효과는 키틴 유도성 네펜테스 트랩 수프의 증
가 희석물과 분생포자를 배양하고, 방법 란에 기술된 바와 같이 OD 280을 측정하여 분석하였다. 1/2 희석율의 키틴
유도성 수프는 셉토리아 트리시티의 성장을 유의적으로 억제하였다(도 10b). 전술한 C.알비칸스 분석에서와 같이 고
농도(미희석물)의 트랩 수프는 효과면에서 제균적이었다(도 10b).
실시예 11
신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제는 라이족토니아 솔라니 및 아스퍼질러스 종의 균사 성장을 억제한다.
일반 식물 병원균인 R.솔라니와 아스퍼질러스의 균사 성장에 네펜테스 트랩 수프가 미치는 항진균 효과는 라이족토
니아 또는 아스퍼질러스의 대수기 배양물을 함유하는 평판에 5배 농축된 트랩 수프 20㎕를 적가하여 측정하였다. 도
10c(화살표)는 트랩 수프 키티나제가 라이족토니아 솔라니 및 아스퍼질러스 종의 균사 성장을 억제한다는 것을 나타
낸다. 따라서, 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제는 시험한 모든 진균 종에 대해 유의적인 성장 억제 및 제균 활성을
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나타내는 것으로 입증되었다.
실시예 12
축퇴성 프라이머를 사용한 PCR에 의한 네펜테스 키티나제의 부분 게놈 서열의 분리
진뱅크(NCBI)의 현 데이터에 따라서, 식물 키티나제는 이들의 아미노산 서열에 기초하여 3가지 종류, 즉 염기성 키티
나제(그룹 1), 염기성 키티나제(그룹 2) 및 산성 키티나제(그룹 3)로 구분되어진다. 본 발명의 신규 키티나제에 대한
유전자를 분리하기 위하여 각 그룹마다 축퇴성 프라이머 세트(방법 란에서 표 I)를 고안하고 PCR 스크리닝을 위한 주
형으로서 잎 총 DNA를 사용하였다. 3개의 부분 키티나제 유전자가 분리되었다. 이 DNA 단편 중 2개(895 bp 및 1.1k
b)를 클로닝하여 서열분석한 결과 모두 그룹 2의 염기성 키티나제 유전자와 상동성인 것으로 나타난 반면, 3번째 단
편(536 bp)은 산성 키티나제에 대해 상동성을 나타냈다. 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제를 생화학적 특성규명(높
은 키티나제 비활성 및 높은 pI값)한 결과, 이는 그룹 I의 염기성 키티나제에 속하는 것으로 나타나는 바, 염기성 키티
나제 그룹에 속하는 게놈 및 cDNA 서열을 분리하였다.
실시예 13
2종의 신규 염기성 네펜테스 키티나제 유전자의 분리 및 완전한 뉴클레오타이드 서열
분리된 부분 서열에 기초하여 역 PCR 전략으로 2종의 염기성 키티나제 유전자의 나머지를 추가 분리하기 위하여 각
유전자에 대한 프라이머 세트(표 II)를 합성하였다. 이 새로운 세트의 역 프라이머(표 II)를 가지고 전체 유전자가 분리
될 때까지 PCR 반응을 반복하고 그 서열을 확인하였다.
[표 VI]
역 PCR 전략으로 그룹 2 염기성 키티나제를 분리하기 위해 고안된 프라이머
네펜테스 키티나제 1 유전자의 서열분석과 증폭은 키티나제 1 유전자의 복수 카피를 나타낸다:도 11은 역 PCR 전
략으로 분리한 염기성 키티나제 1 유전자의 전체 서열을 나타낸 것으로서 Nkchit1b(서열번호 1)로 명명하였다. 추정
상의 해독 개시 코돈에서부터 종결 코돈까지의 이 유전자의 전체 길이는 1572bp이다. 진뱅크의 다른 키티나제와의
서열 정렬 및 콘센서스 접목 부위는 크기가 247bp 및 269bp인 2개의 추정상의 인트론의 존재를 암시하였다. 접목 부
위는 이후 역전사효소의 주형으로서 키틴 유도성 트랩 유래의 mRNA를 사용하여 그 유전자의 전장 cDNA 서열 을 증
폭시키기 위해 고안된 5' 및 3' 유전자 특이적 프라이머(방법 란의 표 IV 참조)를 사용하여 RT-PCR 전략으로 입증하
였다.
주형으로서 게놈 DNA와 특이적으로 고안된 프라이머(표 IV)를 사용하여 직접 PCR 전략으로 분리한 또 다른 키티나
제 1 암호 유전자는 Nkchit1b-gI(서열번호 48)로 명명하였다. 2개의 독특한 키티나제 1 유전자(Nkchit1b 및 Nkchit
1b-gI)는 엑손은 동일하지만 인트론은 상이하였다. 식물 형질전환에는 Nkchit1b-gI를 사용하였다.
네펜테스 키티나제 2 유전자의 서열분석 및 증폭은 아미노산 치환을 가진 키티나제 2 유전자의 복수 카피를 나타낸
다:도 12b는 Nkchit2b(서열번호 2)라고 부른, 역 PCR 전략으로 분리한 염기성 키티나제 2 유전자의 전체 서열을 나
타낸 것이다. 이 유전자의 추정상의 해독 개시 코돈에서부터 종결 코돈까지의 전체 길이는 1673 bp이고 진뱅크의 다
른 키티나제와의 정렬 및 콘센서스 접목 부위는 2개의 추정상의 인트론(248bp 및 468bp)의 존재를 암시했고, 이것은
이후 각각의 cDNA 서열에 기초하여 입증되었다(Nkchit1b에 대해 전술한 바와 유사).
주형으로서 게놈 DNA와 특이적으로 고안된 프라이머(표 V)를 사용한 직접 PCR 전략은 Nkchit2b와 4개의 아미노산
코돈에 차이가 있는 엑손을 가진 Nkchit2b-gII로 명명한, 키티나제 2를 암호화하는 추가 유전자를 나타내었다. 유전
자가 발현되는지 측정하기 위하여 폴리아데닐화 mRNA를 재료 및 방법 란에서 기술한 바와 같이 트랩의 분비 세포로
부터 분리하였다. RT-PCR로는 키티나제 2형 효소를 암호화하는 2종의 cDNA(Nkchit2b-cII 및 Nkchit2b-cIII)를
분리하였다. Nkchit2b-cII cDNA 는 게놈 서열 Nkchit2b-gII에 상응하는 반면 Nkchit2b-cIII에 의해 암호화된 키티
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나제 2는 Nkchit2b-cII의 키티나제 2와 6개의 아미노산의 차이를 보인다. 제4형의 키티나제 2 암호 유전자는 코스미
드 라이브러리에서 분리하였으나, 상응하는 cDNA가 발견되지 않아서, 발현된 2종의 유전자만을 이후 연구에 사용하
였다. 도 12a는 키티나제 2 cDNA으로부터 추론된 2개의 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 즉, 신규 네펜테스 키티나
제 유전자가 다중유전자계에 속한다는 것이 놀랍게도 입증되었다.
실시예 14
신규 네펜테스 카시아나 키티나제의 아미노산 서열 비상동성 및 이의 기능성 관련성
2종의 네펜테스 키티나제 유전자의 추론된 아미노산 서열(cDNA 서열에 기초함)은 NkCHIT1b(서열번호 5) 및 NkC
HIT2b(서열번호 6)로 명명하였다. NkCHIT1b의 아미노산 서열 상동성에 대한 BLAST 조사 결과, 오라이자 사티바(
L37289) 키티나제와 최고(67%)의 동일성과 76% 상동성(DNA 수준에서는 67% 동일성)을 보인 반면, NkCHIT2b는
비티스 비니페라(P51613)의 염기성 엔도키티나제 전구체와 73% 동일성과 78% 상동성( 및 DNA 수준에서의 75%
동일성)을 나타냈다. 도 13은 NkCHIT1b 및 NkCHIT2b의 아미노산 서열 정렬(prettybox)을 보여주고 있다. 이들은
GCG의 GAP 프록램으로 측정했을 때 75% 유사성과 70% 동일성을 갖고 있다.
그룹 1 염기성 키티나제는 일반적으로 5개의 구조 도메인, 즉 1) N-말단 시그널 펩타이드, 2) 시스테인 고밀도 도메
인, 3) 프롤린 고밀도 힌지 영역, 4) 촉매성 도메인 및 5) 카르복시 말단 연장부로 이루어진다. 도 13에 예시된 바와
같이, 네펜테스 키티나제는 길이와 아미노산 조성, 즉 시스테인 고밀도 도메인과 촉매성 도메인의 차이는 있지만 모두
시그널 펩타이드를 갖고 있다. 하지만, 프롤린 고밀도 힌지 영역은 NkCHIT1b에만 존재한다. 힌지 영역의 길이는 다
른 키티나제 마다 달라지는 것으로 알려져 있으며, NkCHIT2b에서와 같이 모두 없을 수도 있다. 소수성 아미노산이
많은 카르복시 말단 연장부는 액포 표적화(Graham, 1994)의 시그널인 것으로 추정된다. 예를 들어, 담배 키티나제의
경우, C-말단 단부에 NLLVDTM 아미노산 콘센서스 서열의 결실은 변형된 키티나제의 아포플라스트로의 분비를 유
도했다(Chrispeels and Raikhel, 1992). 2종의 네펜테스 카시아나 염기성 키티나제의 C-말단 부분을 비교한 결과 N
kCHIT2b에서만 8개 아미노산이 긴 소수성 연장부가 존재하는 것으로 확인되었다.
도 14와 15는 신규 키티나제와 최고의 아미노산 서열 상동성을 나타내는 단백질 데이터베이스에서 얻어진 단자엽 및
쌍자엽 키티나제 서열과 상기 2종의 네펜테스 키티나제 각각을 복수 서열 정렬한 것이다. 기능적 중요성이 있는 것으
로 추정되는 보존적 아미노산 잔기(Graham, 1994; Hamel et al., 1997)는 다른 색으로 표시하였다. 즉, 대부분의 서
열의 키틴 결합 영역에서 동일한 위치에 존재하는 8개의 시스테인(C)은 도메인을 밀집된 활성 형태로 정확히 폴딩시
키는 이황화 가교의 형성에 관여한다. 촉매작용에 중요한 것으로 밝혀져 있는(Graham, 1994; Hamel et al., 1997)
글루탐산(E) 및 아스파라긴(N)(녹색 화살표) 뿐만 아니라 활성 부위 기하형태에 중요 역할을 하는 트레오닌(T) 및 글
루타민(Q)(적색 화살표)은 모두 신규 네펜테스 키티나제 둘다에 존재하였다(도 14 및 15). 하지만, 촉매성 틈에서 기
질 을 결합시키는 것으로 사료되는 보존적 타이로신(Y)은 NkCHIT2b에서 페닐알라닌(F)(청색 화살표, 도 15)으로 교
체되었다. NkCHIT2b가 NkCHIT1b는 물론 다른 키티나제와 구별되는 2가지 다른 현저한 차이는 알라닌 대신에 교
체된 글루탐산(흑색 화살표) 및 발린(갈색 화살표)이다(도 15). 즉, 신규 네펜테스 키티나제는 다른 종의 키티나제와
아미노산 서열 상동성 영역을 갖고 있지만, 촉매성 틈의 조성이 명백하게 독특하다.
실시예 15
NkCHIT2b의 3차원 모델링은 촉매성 틈의 독특한 구조를 입증한다.
전술한 고유 아미노산 서열의 가능한 효과를 조사하기 위하여 NkCHIT2b(트랩 수프에 존재하는 구성성 키티나제인
것으로 추정)의 3차원 구조 모델링(SWISS-MODEL Protein Modeling, http://www.expasy,ch/swissmod/SWISS-
MOLEL)을 수행하였다. 도 16a와 도 16b는 이 정보를 요약한 것이다. 예측은 호르데움 불가리 L(보리) 종자 유래의
엔도키티나제의 결정 구조에 기초하였다(Song et al., 1993; PDB and Swissprot 수탁 번호 각각 1CNS 및 p23951).
도 16a는 NkCHIT2b의 서열을 이 NkCHIT2b와 가장 근접한 상동성을 보이는 진뱅크의 서열과 복수 서열 정렬한 단
편을 나타낸 것으로서, 여기에는 보리 키티나제의 서열도 포함시켰다. 전술한 교체된 아미노산 잔기 외에도, 보리 키
티나제에서 촉매 활성에 필수 역할을 하는 것으로 관찰된 2개의 NkCHIT2b 글루탐산(#134 및 156)과 보리에서 기질
결합 틈에 존재하는 아스파라긴 #191(Anderson et al., 1997)이 관찰되었다. 상기 글루탐산(NkCHIT2b에서 Glu134
및 Glu156에 해당하는 보리 키티나제 중의 Glu 67 및 Glu 89) 중 어느 하나의 돌연변이는 보리 키티나제 활성을 실
질적으로 상실시킨다. 이와 마찬가지로 아스파라긴(NkCHIT2b의 Asn 191에 상응하는 보리의 Asn124)은 중요한 기
능적 역할을 하는 것으로 관찰되었다(Anderson et al., 1997).
도 16a는 동일 분자를 좌측과 우측에서 관찰했을 때의 NkCHIT2b 모델을 도시한 것이다. 관련 아미노산 잔기의 위치
를 이 분자 상에 표시하였고, 이들의 상대적 위치에 따라 분자의 좌측과 우측에 위치하였다. 보리 키티나제의 촉매 활
성에 중요한 것으로 관찰된 Glu134 및 156과 Asn 191은 촉매 틈에 위치하는 것을 볼 수 있다. 흥미롭게도 NkCHIT2
b의 소수성 아미노산 Phe190 이 보리에서 중요한 기능적 역할을 하는 Asn191에 인접한, 촉매 틈에 위치한 고도 보
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존성 극성 타이로신을 대체하고 있음이 주목된다. 또한, 하전을 띤 아미노산인 Glu211과 Lys212는 보리의 대응 위치
에 존재하는 소수성(알라닌) 및 극성(트레오닌) 아미노산을 대체하고 있다. 촉매 틈 부근에서의 이러한 하전 변화는
신규 네펜테스 키티나제 고유의 촉매 활성 변화를 설명할 수 있다.
실시예 16
신규 네펜테스 키티나제의 해독후 변형: NkCHIT1b 및 NkCHIT2b의 O-글리코실화 부위
네펜테스 및 다른 식물 키티나제 사이의 또 다른 차이를 규명하기 위하여 NkCHIT1b 및 NkCHIT2b의 가능한 O-글
리코실화 부위를 예측하였다. 일부 식물 키티나제는 당단백질인 것으로 밝혀져 있지만(Margis-Pinhiero et al., 199
1, De Jong et al., 1992), 대부분은 그렇지 않다(Graham, 1994).
예측은 해독후 변형을 예측하는 ExPaSy 몰리큘라 서버(NetOGlyc prediction, http://www.cbs.dtu.dk/services/Ne
tOGlyc)로 실시하였다. 놀랍게도 다수의 글리코실화 부위가 동정되었다. 도 17과 18은 NkCHIT1b가 9개의 가능한
글리코실화 부위를 갖고 있는 반면, NkCHIT2b에서는 단지 1개의 가능한 부위만이 예측되었다(도 14 및 15 참조, 자
주색 점). 9개 부위(NkCHIT1b)는 모두 프롤린 고밀도 힌지 영역에 집중되어 있었다. 즉, 이러한 예측치 못한 해독후
변형은 신규 네펜테스 키티나제의 특성 및 높은 비활성에 중요할 수 있다.
실시예 17
네펜테스 트랩 분비 세포에 존재하는 키티나제 유전자의 발현
네펜테스 트랩 수프 키티나제는 매우 높은 키티나제 활성을 나타낸다. 하지만, 트랩 수프는 단백질 합성에 있어서 활
성적이지 않다. 따라서, 분리된 키티나제의 합성에 중요한 역할을 하는 트랩 분비 영역(포충엽의 하부)으로부터 신규
네펜테스 키티나제 mRNA를 동정 및 분리하는 것이 중요하였다.
Nkchit2b는 비유도 트랩에서 우선적으로 발현된다:총 RNA는 트랩의 하단부에서 특정 고온 붕산염/단백분해효소 K
방법(Schulze et al., 1999)을 사용하여 분리하였다. mRNA는 올리고 dT를 접합시킨 자기 DynaBeads(Dynal, Norw
ay)를 사용하여 총 RNA로부터 분리한 후, 프라이머로서 올리고(dT) 12-18과 MM-LV 역전사효소(RT)를 사용하여
총 cDNA를 합성하였다. 지금까지 분리된 3종의 다른(2개는 완전한 염기성이고 1개는 부분 산성) 네펜테스 키티나제
의 차이를 규명하기 위하여 방법 란 에 기술된 바와 같이 각 유전자에 대한 유전자 특이적 프라이머 세트를 합성하였
다(#7-9, 표 IV). 그 다음, 이 프라이머들을 사용하여 3개의 유전자 중에서 다양한 조건하에 트랩 분비 세포에서 가장
활성적으로 전사되는 유전자를 측정하였다.
도 19는 염기성 키티나제 유전자 분리에 사용했던 염기성 키티나제 축퇴성 프라이머(#1-2, 표 I) 2 세트와 함께 프라
이머 3 세트(Nkchit1b, Nkchit2b 및 산성 키티나제)를 사용하여 RT-PCR을 수행한 결과를 도시한 것이다. 이와 같이
연구된 3종의 키티나제 중에서 Nkchit2b가 트랩 분비 영역의 mRNAdp 존재하는 주요 키티나제 전사체를 포함한다
는 것을 분명하게 알 수 있다. Nkchit1b 또는 산성 키티나제 프라이머를 이용한 증폭으 매우 희미한 밴드만을 산출하
였는데, 이것은 트랩 조직내에서의 이들의 전사 수준이 매우 낮다는 것을 암시한다. 동일한 cDNA 제조물을 사용한
축퇴성 프라이머에 의한 PCR 증폭은 특징적인 밴드를 전혀 제공하지 않았다. cDNA 대신에 게놈 DNA를 주형으로
사용하였을 때, 보다 긴 전사 산물이 검출되었다(각각 레인 1과 4에 비해 레인 3과 6). 이로써, 두 염기성 유전자에는
프라이머의 각 세트 사이의 증폭된 영역에 인트론 크기와 정확하게 일치하는 인트론이 위치한다는 것을 확인하였다.
키틴 유도성 트랩에 존재하는 신규 네펜테스 트랩 수프 키티나제의 교호적 발현:전술한 실시예는 폐쇄 트랩으로 키
틴을 주입하면 적어도 3종의 신규 수프 키티나제의 발현이 유도된다는 것을 입증하고 있다. 유도 트랩 대 비유도 트랩
의 키티나제 프로필의 또 다른 특성을 밝히기 위하여, 유도 및 비유도 트랩 유래의 cDNA 를 이용한 RT-PCR 분석 산
물을 증폭의 주형으로서 사용하였다. 도 20은 유도 트랩에서 Nkchit1b 전사체의 양이 명백히 증가한 반면 Nkchit2b
양은 크게 변화하지 않음을 보여준다. 또한, 축퇴성 프라이머 세트(그룹 2)를 사용했을 때 유도 트랩에서 또 다른 키
티나제 산물이 관찰되었다. 이 435bp 밴드를 분리하여 클로닝 및 서열분석한 결과 Nkchit2b-cIII과 동일하였다. 즉,
Nkchit2b-cIII의 전사체 역시 키틴 유도성이다.
실시예 18
돌연변이 담배 식물 및 현탁 배양물에서 Nkchit1b-gI, Nkchit2b-gII 및 Nkchit2b-cIII에 의해 암호화된 신규 네펜테
스 키티나제의 발현
상기 입증된 바와 같이 트랩 수프에는 단지 극소량의 키티나제 단백질이 존재하여(실시예 6), 이 효소의 정제와 생산
에 상당한 장애물임을 밝힌 바 있다. 또한, 근래 살생제 화합물의 농업 및 임상 분야에서의 용도는 개발중인 DNA 및
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클로닝 기술과의 상용성을 필요로 한다. 즉, 이 키티나제의 돌연변이 발현 및 정제 방법은 대단히 흥미롭다. 하지만,
키메라성 클론된 단백질의 정확한 발현과 생물학적 활성 유지는 종종 광범위한 실험과 유전자 조작을 요구하는 것으
로 알려져 있다. 이를 위해 당해의 신규 네펜테스 키티나제 유전자에는 그 3' 말단에 9개 아미노산 길이의 HA 펩타이
드 태그를 해독적으로 융합시켰다(Ferrando et al., 2001). 이 HA 펩타이드는 각 키티나제의 유의적 양을 정제하고
이어서 각 효소의 속도론적 성질을 측정할 수 있게 해준다.
이 HA 암호 서열과 함께 식물 발현 카세트를 보유하는 플라스미드 내로 유전 자의 추가 클로닝을 가능하게 하는 특이
적으로 고안된 프라이머(표 IV)와 특이적 프루프 리딩 Taq 폴리머라제를 사용한 직접 PCR 전략으로 Nkchit1b-gI,
Nkchit2b-gII 및 Nkchit2b-cIII을 합성하였다. 그 다음, 키티나제-HA 카세트를 pPCV702 이중 벡터에 클로닝하여[
Koncz, et al.,(1989) Proc. Natl. Acad.Sci. USA 86:8467-8471], 후속으로 담배 잎 반의 아그로박테리움 매개 형
질전환에 이용하였다. 도 21은 nptII 선택성 마커 외에, 3' 말단에 HA 에피토프를 암호화하는 서열이 융합되어 있고
구성성 CaMV 35S 프로모터에 의해 구동되는 Nkchit1b-gI, Nkchit2b-gII 또는 Nkchit2b-cIII 유전자 중 어느 하나
를 보유하는 최종 pPCV702 벡터를 도시한 것이다. 유전자조작된 아그로박테리움과 잎반을 동시배양한 후, 카나마이
신 및 호르몬의 존재하에 새순 재생을 유도하였다. 형질전환으로부터 수득되는 카나마이신 내성 식물을 항-HA 항체
를 이용한 웨스턴 분석으로 각 키티나제-HA 융합 단백질을 발현하는지 선별하였다. 도 22와 도 23은 카나마이신 내
성 식물의 일반적인 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다. 음성 및 양성 대조군으로서 각각 야생형 담배(NN) 및 돌연변
이 담배가 발현하는 HA 태그(MW 약 59,000 달톤)에 융합된 세라티아 키티나제를 사용하였다. HA 태그에 융합된 키
티나제 1 및 키티나제 2 단백질의 예상 크기는 각각 36,000 및 32,700 달톤이다. 선별한 6개 식물 중에서 4개는 키티
나제1 효소를 발현하였다(도 22). 관찰된 분자량은 예상한 바와 같이 담배 식물에서의 네펜테스 키티나제의 정확한
가공을 시사한다. 식물 #4는 비교적 높은 양의 키티나제 1-HA 산물을 나타내었는데, 이는 이 돌연변이 식물이 도입
된 키티나제1 돌연변이유전자를 여러 카피 포함하고 있음을 시사한다. 따라서, 식물 #4는 키티나제1 단백질을 후속
정제할 수 있는 우수한 후보이다. 도 23에서는 선별된 5개 식물 중 2개의 식물에서 키티나제2 효소의 발현이 입증된
다. 키티나제2-HA 단백질의 관찰된 분자량은 32,700 달톤이었는데, 이는 이 돌연변이 식물 내에 정확한 인트론 접목
이 도입되어 있음을 시사한다.
네펜테스 키티나제는 모두 그 단백질을 소포체로 유도하는 리더 펩타이드를 포함한다. 하지만, 키티나제2만은 단백질
을 액포로 유도하는 카르복시 말단 연장부(CTE)를 갖고 있다. 따라서, CTE가 없는 키티나제1은 세포외 공간으로 분
비될 것으로 추정된다(Legrand et al., 1987; Swegle et al., 1992; Vad et al., 1991). 즉, 돌연변이 식물은 물리적,
효소적 완전성을 모두 보유하는 신규 네펜테스 키티나제를 정확하게 발현했다.
실시예 19
다른 식충성 식물의 신규 키티나제 활성
이상의 실시예들에서는 네펜테스 카시아나(네펜타시에 과)는 고활성의 신규 키티나제 일군을 보유함을 보여주고 있
다. 이러한 높은 키티나제 활성은 다른 종에서는 입증된 바 없지만 다른 두 과에 속하는 3가지 식충성 식물 속(디오네
아 종, 드로세라 종 및 사라세니아 종)(처음 2개는 드로세라시에 과에 속하고 3번째 식물은 사라세니아시에 과에 속함
)을 선별하였다. 이 세 식물을 키티나제 활성을 물론 항진균 활성에 대해 선별하였다. 이 세 식충성 식물은 곤충 먹이
를 포획하기 위한 각각의 구조적 기구를 구성하는 반면; 네펜테스 및 사라세니아는 곤충을 소화하기 위하여 트랩 수
프를 이용하고, 다른 식물은 먹이를 포획하는 점착성 소적을 갖고 있거나 먹이 주위를 감싸는 잎을 갖고 있다. 따라서,
트랩 수프 보다는 트랩 조직 추출물을 가지고 키티나제 활성 분석 및 항진균 활성 분석을 실시하였다. 표 Ia(상기 실
시예 9 참조)는 인간 병원균 칸디다 알비칸스에 대한 조직 추출물의 항진균 활성 결과를 요약한 것이다. 디오네아 및
드로세라 추출물은 심지어 조사된 최저 희석율(1/32)에서도 유효한, 칸디다 알비칸스 성장의 매우 강력한 억제작용을
나타내는 것으로 관찰된다. 사라세니아 역시 고농도에서 나타나지만 칸디다 알비칸스의 성장을 억제하는데 활성적이
다. 이러한 결과를 종합해보면 무엇보다도 식충성 식물 추출물의 인간 병원균 칸디다 알비칸스에 대한 신규 제균 효
과가 확인된다.
도 24는 3가지 다른 식충성 식물의 키티나제 활성 결과를 요약한 것이다. 세 식물 모두에서 강한 키티나제 활성 밴드
가 검출되었다. 이동 거리에 따르면 드로세라 스파툴라타에는 2개의 다른 키티나제가 존재하였다. 이러한 결과는 3가
지 다양한 종류의 식충성 식물이 복수 형태의 활성 키티나제를 보유하고 있음을 시사한다. 다른 식물 유래의 키티나
제와 상대적 활성을 비교하기 위하여 드로세라 및 디오네아 유래의 키티나제 유전자를 분리하였다. 도 25는 진뱅크(
BLAST 조사)에서 가장 근접한 상동성을 보이는 식물 키티나제인 드로세라 유래의 키티나제(서열번호 7)과 디오네아
유래의 키티나제(서열번호 8), 두 키티나제의 부분 유전자에서 추론된 아미노산 서열을 정렬한 것이다. 드로세라 키
티나제는 알리움 사티범 및 솔라넘 튜베로섬과 가장 근접한 상동성(각각 81%와 76%의 동일성)을 보이고, 디오네아
는 메디카고 트루카툴라 및 피섬 사티범과 가장 근접한 상동성(각각 76% 및 75% 동일성)을 보인다. 부분 드로세라
키티나제는 키티나제 1(Nkchit1b) 및 키티나제 2(Nkchit2b) 와 각각 77% 및 73% 동일성이 있는 반면, 디오네아 키
티나제는 각각 73% 및 67%의 동일성을 보였다. 이 유전자들의 5' 및 3' 서열을 분리하면 다른 공급원 유래의 키티나
제와의 유사성을 보다 정확하게 추정할 수 있을 것이다.
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실시예 20
트랩 수프 키티나제의 속도론적 성질
네펜테스 트랩 수프에 존재하는 키티나제 활성의 또 다른 생화학적 특성을 규명하기 위하여 수프 키티나제의 속도론
적 성질을 재조합 세라티아 마르세슨스 키티나제의 해당 성질과 비교하였다.
폐쇄 트랩으로부터 멸균 트랩 수프를 채취하고 스피드백싱(speedvaccing)으로 4.8배 농축시켰다. 세라티아 마르세
슨스 키티나제(동결건조 분말)는 시그마(C1650)에서 구입하여 H 2 O에 용해시켰다.
트랩 수프에 존재하는 키티나제 단백질이 극소량인 관계로, 일반 방법으로는 정확한 단백질 함량을 측정할 수 없다(
실시예 6 참조). 따라서, 활성 분석에 사용된 효소 함량을 측정하기 위하여 네펜테스 키티나제 단백질 농축물의 분리
된 cDNA에서 추론된 크기에 상응하는 약 32 내지 35kDa 밴드의 함량을 SDS-PAGE 및 은 염색으로 측정하였다. 이
와 마찬가지로, 구입한 세라티아 마르세슨스 키티나제의 함량도 측정하였다.
도 1은 은 염색 후 12% SDS-PAGE 겔 상에 존재하는 네펜테스 및 세라티아 키티나제를 대략적으로 정량한 결과를
도시한 것이다. 세라티아(약 58kDa) 및 네펜테 스(약 32 내지 35kDa) 키티나제 정량 조정을 위해 각각 BSA(약 66k
Da) 및 탄산탈수효소(약 29kDa)를 사용하였다. 활성 분석에 사용된 키티나제의 함량은 세라티아의 경우에는 약 100
ng(5㎕ 중에)인 것으로 추정되었다. 네펜테스 키티나제인 경우에는 효소를 나타낼 수 있는 희미한 밴드만이 32 내지
35kDa에서 관찰되어 키티나제의 함량은 최대 20 내지 30ng(30㎕ 중에) 범위인 것으로 추정되었다.
두 제조물에 존재하는 효소의 속도론적 프로필을 측정하기 위하여 키티나제 활성 분석을 증가 농도의 기질(사량체: p
-니트로페닐-β-D-N,N',N'-트리아세틸-키토트리오스, 시그마 N8638)의 존재하에 실시하고 p-니트로페놀 방출율
을 측정하였다.
도 2는 네펜테스 키티나제가 사라티아 효소 보다 높은 K m을 갖는 것으로 보이나 그 활성은 여전히 기질 농도와 직
선의 상관관계를 갖는 반면, 세라티아 키티나제는 기질 농도 9㎍/분석에서 이미 최대 활성에 도달하였음을 보여준다.
또한, 반복된 분석에서 네펜테스 효소는 일반 미카엘리스-멘텐 방식과 상이한 Vo 및 [S] 사이의 관계를 보였다(데이
터는 제시안됨). 알로스테릭 효소에 특징적인 S자형(쌍곡선이 아닌) 포화 곡선이 관찰되었다. 이 S자형 속도론적 양
태는 일반적으로 복수 단백질 서브유닛 사이의 협력적 상호작용을 반영한다[Lehninger et al.,(1993) Principles in
Biochemistry 229-233]. SDS 외에 β-머캅토에탄올의 존재가 수프 키티나제를 불활성화시키는 반면 잎 키티나제
활성에는 영향을 미치지 않는다는 것은 이미 밝힌 바 있다(실시예 5). 이러한 결과에서 이미 트랩 수프 키티나제가 분
자간 이황화 결합에 의해 함께 유지되는 이량체일 것임을 추정하고 있었다. 대부분의 식물 키티나제는 약 25 내지 35
kDa의 단량체로서 활성을 띠지만, 이량체 키티나제는 율무 종자에 동정된 바 있다[L.S.Graham and M.B.Sticklen, 1
994]. 이상 활성에 대해 연구한 트랩 수프 내에는 1종 이상의 키티나제가 존재할 수 있기 때문에 네펜테스 키티나제
의 본성에 대한 명확한 결론을 내릴 수는 없다. 따라서, 최종 특성은 돌연변이 식물에서 별도 발현시킨 후 정제한 효소
를 가지고서 규명할 수 있을 것이다.
참고문헌
(다른 참고문헌은 명세서에 인용되어 있다)
공개특허 10-2004-0101889
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(57) 청구의 범위
청구항 1.
공개특허 10-2004-0101889
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식충성 식물의 조직이나 수프(soup)에서 분리된, 엔도키티나제 활성을 가진 것을 특징으로 하는 적어도 1종의 단백
질을 포함하는 효소 조성물.
청구항 2.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이하인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 3.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII 폴리클론 항체와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 효소 조성물
.
청구항 4.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 환원 조건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로 하
는 효소 조성물.
청구항 5.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을 특
징으로 하는 효소 조성물.
청구항 6.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특징
으로 하는 효소 조성물.
청구항 7.
활성 성분으로서 제1항에 기재된 효소 조성물과 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 8.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항진균 활성을 나타내는 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 9.
제 8 항에 있어서, 항진균 활성은 제균 활성인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 10.
제 8 항에 있어서, 항진균 활성은 항 칸디다 알비칸스 활성인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 11.
활성 성분으로서 제1항에 기재된 효소 조성물과 담체 또는 희석제를 포함하는, 키틴 함유 병원균을 살균하기 위한 조
성물.
청구항 12.
활성 성분으로서 제1항에 기재된 효소 조성물과 농경법적으로 허용성인 담체를 포함하는 농경용 조성물.
청구항 13.
제 1 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and
Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했
을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나
또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 14.
제 13 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 서열번호 5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분을 포함하는 것
이 특징인 효소 조성물.
청구항 15.
제 1 항에 있어서, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조직인 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 16.
제 1 항에 있어서, 수프는 트랩 수프인 것이 특징인 효소 조성물.
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청구항 17.
제 1 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dionea
sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 18.
식충성 식물의 조직이나 수프(soup)의 단백질 추출물을 포함하되, 이 단백질 추출물이 엔도키티나제 활성을 나타내
는 적어도 1종의 단백질을 포함하는 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 19.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이하인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 20.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII 폴리클론 항체와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 효소 조성
물.
청구항 21.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 환원 조건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로
하는 효소 조성물.
청구항 22.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을 특
징으로 하는 효소 조성물.
청구항 23.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특징
으로 하는 효소 조성물.
청구항 24.
활성 성분으로서 제18항에 기재된 효소 조성물과 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 25.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항진균 활성을 나타내는 것을 특 징으로 하는 효소 조성물.
청구항 26.
제 25 항에 있어서, 항진균 활성은 제균 활성인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 27.
제 25 항에 있어서, 항진균 활성은 항 칸디다 알비칸스 활성인 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 28.
활성 성분으로서 제18항에 기재된 효소 조성물과 담체 또는 희석제를 포함하는, 키틴 함유 병원균을 살균하기 위한
조성물.
청구항 29.
활성 성분으로서 제18항에 기재된 효소 조성물과 농경법적으로 허용성인 담체를 포함하는 농경용 조성물.
청구항 30.
제 18 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and
Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했
을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나
또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 효소 조성물.
청구항 31.
제 30 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 서열번호 5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분을 포함하는 것
이 특징인 효소 조성물.
공개특허 10-2004-0101889
- 38 -
청구항 32.
제 18 항에 있어서, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조직인 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 33.
제 18 항에 있어서, 수프는 트랩 수프인 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 34.
제 18 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dione
a sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 효소 조성물.
청구항 35.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman
) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열
번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열
번호 8과 77% 이상 동일한 폴리펩타이드를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 분리된 핵산.
청구항 36.
제 35 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4 및 48이나 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서
선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 37.
제 35 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 5, 6, 7 및 8이나 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이
특징인 분리된 핵산.
청구항 38.
제 35 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및
합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 39.
제 35 항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
청구항 40.
제 39 항에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
청구항 41.
서열번호 1, 2, 3, 4 및 48이나 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는
것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 42.
제 41 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및
합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 43.
제 41 항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
청구항 44.
제 43 항에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
청구항 45.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고 적어도 30개 아미노산의 시그널 펩타이드를 포함하는 폴리펩타이드를 암호화하는
폴리뉴클레오타이드 서열을 함유한 분리된 핵산.
청구항 46.
제 45 항에 있어서, 시그널 펩타이드는 단백질 분비를 위한 것인 분리된 핵산.
청구항 47.
공개특허 10-2004-0101889
- 39 -
제 45 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 48에 기재된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징인
분리된 핵산.
청구항 48.
제 45 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 5에 기재된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 49.
제 45 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및
합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 50.
제 45 항에 있어서, 시그널 펩타이드는 서열번호 47에 기재된 것인 분리된 핵산.
청구항 51.
제 45 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및
합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 52.
제 45 항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
청구항 53.
제 45 항에 기재된 핵산 작제물을 함유하는 숙주 세포.
청구항 54.
갭 중량이 50이고, 길이 중량이 3이며, 평균 정합성이 10이고 평균 부정합성이 -9인 스미드 앤드 워터만(Smith and
Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했
을 때 서열번호 1과 67% 이상 동일하거나, 또는 서열번호 2와 75% 이상 동일한 서열을 포함하는 분리된 핵산.
청구항 55.
제 54 항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
청구항 56.
제 55 항에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
청구항 57.
제 54 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열 및
합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 58.
서열번호 1, 2, 3, 4 또는 48에 기재된 분리된 핵산과 특이적으로 하이브리드할 수 있는 적어도 17개 염기로 이루어
진 올리고뉴클레오타이드.
청구항 59.
핵산 증폭 반응에서 일부분의 특이적 증폭을 유도하기 위해서 각각 반대 배향으로 서열번호 1, 2, 3, 4 또는 48과 특
이적으로 하이브리드할 수 있는 적어도 17개 염기로 이루어진 올리고뉴클레오타이드 쌍.
청구항 60.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman
) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열
번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열
번호 8과 77% 이상 동일한 분리된 폴리펩타이드.
청구항 61.
활성 성분으로서 제60항에 기재된 분리된 펩타이드와 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물.
청구항 62.
공개특허 10-2004-0101889
- 40 -
제 61 항에 있어서, 약학적 허용성 담체 또는 희석제가 국소 투여 또는 경구 투여를 위해 배합되는 것이 특징인 약학
적 조성물.
청구항 63.
활성 성분으로서 제60항에 기재된 효소 조성물과 담체 또는 희석제를 포함하는, 키틴 함유 병원균을 살균하기 위한
조성물.
청구항 64.
활성 성분으로서 제60항에 기재된 효소 조성물과 농경법적으로 허용성인 담체를 포함하는 농경용 조성물.
청구항 65.
서열번호 5, 6, 7 및 8로 구성된 군 중에서 선택되는 분리된 폴리펩타이드 또는 이의 활성 부분.
청구항 66.
활성 성분으로서 제65항에 기재된 분리된 폴리펩타이드와 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성
물.
청구항 67.
활성 성분으로서 제65항에 기재된 효소 조성물과 담체 또는 희석제를 포함하는, 키틴 함유 병원균을 살균하기 위한
조성물.
청구항 68.
활성 성분으로서 제65항에 기재된 효소 조성물과 농경법적으로 허용성인 담체를 포함하는 농경용 조성물.
청구항 69.
키틴 함유 병원균과 관련된 질환이나 증상이 있는 개체에게, 활성 성분으로서 식충성 식물의 트랩 수프 또는 트랩 조
직에서 유래하고 엔도키티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을 포함하는 단백질 추출물을 함유한 약학적 조
성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여, 상기 개체를 치료하는 방법.
청구항 70.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 71.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII 폴리클론 항체와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 72.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 환원 조건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로
하는 방법.
청구항 73.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을 특
징으로 하는 방법.
청구항 74.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특징
으로 하는 방법.
청구항 75.
제 69 항에 있어서, 약학적 조성물이 추가로 약학적 허용성 담체 또는 희석제를 포함하는 것이 특징인 방법.
청구항 76.
제 69 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and
Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했
을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나
또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 77.
공개특허 10-2004-0101889
- 41 -
제 76 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 서열번호 5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징인
방법.
청구항 78.
제 69 항에 있어서, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조직인 것이 특징인 방법.
청구항 79.
제 69 항에 있어서, 수프는 트랩 수프인 것이 특징인 방법.
청구항 80.
제 69 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dione
a sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
청구항 81.
(a) 식충성 식물의 트랩 수프 또는 트랩 조직으로부터 엔도키티나제 활성을 나타내는 단백질 분획을 추출하는 단계;
및
(b) 이 단백질 분획을 약학적 허용성 담체 또는 희석제와 혼합하여 키틴 함유 병원균과 관련된 질환이나 증상을 치료
하는데 유용한 약학적 조성물을 수득하는 단계를 포함하여, 키틴 함유 병원균과 관련된 질환이나 증상을 치료하는데
유용한 약학적 조성물을 제조하는 방법.
청구항 82.
제 81 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dione
a sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
청구항 83.
제 81 항에 있어서, 식충성 식물의 트랩 수프 또는 트랩 조직을 단계 (a) 이전에 키틴에 노출시키는 것을 추가로 포함
하는 것이 특징인 방법.
청구항 84.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman
) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열
번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열
번호 8과 77% 이상 동일한 외인성 폴리펩타이드를 식물내에서 발현시키는 것을 포함하여, 키틴 함유 병원균에 대한
식물의 감수성을 감소시키는 방법.
청구항 85.
제 84 항에 있어서, 외인성 폴리펩타이드가 서열번호 5, 6, 7 및 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분으로부터 선택되
는 것이 특징인 방법.
청구항 86.
활성 성분으로서 식충성 식물의 수프 또는 조직에서 유래하고 엔도키티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을
포함하는 단백질 추출물을 함유한 조성물에 복수의 식물을 노출시키는 것을 포함하여, 냉해에 대한 식물의 감수성을
감소시키는 방법.
청구항 87.
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 88.
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII 폴리클론 항체와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 89.
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 환원 조건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로
하는 방법.
청구항 90.
공개특허 10-2004-0101889
- 42 -
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을 특
징으로 하는 방법.
청구항 91.
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특징
으로 하는 방법.
청구항 92.
제 86 항에 있어서, 조성물이 추가로 담체 또는 희석제를 포함하는 것이 특징인 방법.
청구항 93.
제 86 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and
Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했
을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나
또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 94.
제 93 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 서열번호 5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징인
방법.
청구항 95.
제 86 항에 있어서, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조직인 것이 특징인 방법.
청구항 96.
제 86 항에 있어서, 수프는 트랩 수프인 것이 특징인 방법.
청구항 97.
제 86 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dione
a sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
청구항 98.
(a) 식충성 식물의 트랩 조직이나 트랩 수프로부터 단백질 추출물을 제조하는 단계; 및
(b) 이 단백질 추출물로부터 키티나제 활성 분획을 분리하여 높은 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 분
리하는 단계를 포함하여, 높은 엔도키티나제 활성을 나타내는 폴리펩타이드를 분리하는 방법.
청구항 99.
제 98 항에 있어서, 추가로 단계 (a) 이전에 트랩 조직 또는 트랩 수프를 키틴에 노출시키는 단계를 포함하는 것이 특
징인 방법.
청구항 100.
제 98 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dione
a sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
청구항 101.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman
) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열
번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열
번호 8과 77% 이상 동일한 외인성 폴리펩타이드를 복수의 식물내에서 발현시키는 것을 포함하여, 냉해에 대한 식물
의 감수성을 감소시키는 방법.
청구항 102.
제 101 항에 있어서, 외인성 폴리펩타이드가 서열번호 5, 6, 7 및 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분으로부터 선택되
는 것이 특징인 방법.
청구항 103.
공개특허 10-2004-0101889
- 43 -
활성 성분으로서 식충성 식물의 수프 또는 조직에서 유래하고 엔도키티나제 활성을 나타내는 적어도 1종의 단백질을
포함하는 단백질 추출물을 함유한 조성물에 복수의 식물을 노출시키는 것을 포함하여, 냉해에 대한 식물의 감수성을
감소시키는 방법.
청구항 104.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 pI가 10 이하인 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 105.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 항 ChiAII 폴리클론 항체와 반응하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 106.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 환원 조건에 노출 후 엔도키티나제 활성을 나타내지 않는 것을 특징으로
하는 방법.
청구항 107.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 32.7kDa인 것을
특징으로 하는 방법.
청구항 108.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 12% SDS-PAGE로 측정했을 때 겉보기 분자량이 약 36kDa인 것을 특
징으로 하는 방법.
청구항 109.
제 103 항에 있어서, 조성물이 추가로 담체 또는 희석제를 포함하는 것이 특징인 방법.
청구항 110.
제 103 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith an
d Waterman) 알고리듬을 이용하는 위스콘 신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정
했을 때 서열번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거
나 또는 서열번호 8과 77% 이상 동일한 것을 특징으로 하는 방법.
청구항 111.
제 110 항에 있어서, 적어도 1종의 단백질은 서열번호 5, 6, 7 또는 8에 기술된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징
인 방법.
청구항 112.
제 103 항에 있어서, 조직은 트랩 조직 및/또는 잎 조직인 것이 특징인 방법.
청구항 113.
제 103 항에 있어서, 수프는 트랩 수프인 것이 특징인 방법.
청구항 114.
제 103 항에 있어서, 식충성 식물은 네펜테스 종(Nepenthes ssp.), 드로세라 종(Drosera sp.), 디오네아 종(Dion
ea sp.) 및 사라세니아 종(Sarracenia sp.)으로 구성된 군에서 선택되는 것이 특징인 방법.
청구항 115.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 갭 형성값이 8이고 갭 연장 패널티가 2인 스미드 앤드 워터만(Smith and Waterman
) 알고리듬을 이용하는 위스콘신 서열분석 패키지의 베스트피트(BestFit) 소프트웨어를 사용하여 측정했을 때 서열
번호 5와 70% 이상 동일하거나, 서열번호 6과 75% 이상 동일하거나, 서열번호 7과 81% 이상 동일하거나, 또는 서열
번호 8과 77% 이상 동일한 분리된 폴리펩타이드를 암호화하는 외인성 폴리뉴클레오타이드 서열을 포함하는 식물,
식물 조직 또는 식물 종자.
청구항 116.
제 115 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1, 2, 3, 4 및 48이나 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에
서 선택되는 것이 특징인 식물, 식물 조직 또는 식물 종자.
청구항 117.
공개특허 10-2004-0101889
- 44 -
제 115 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 5, 6, 7 및 8이나 이의 활성 부분으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이
특징인 식물, 식물 조직 또는 식물 종자.
청구항 118.
제 115 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열
및 합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 식물, 식물 조직 또는 식물 종자.
청구항 119.
엔도키티나제 활성을 갖고 있고, 프롤린 아미노산이 10개 이상 내지 15개 이하인 프롤린 고밀도 영역을 포함하는 폴
리뉴클레오타이드 서열을 함유한 분리된 핵산.
청구항 120.
제 119 항에 있어서, 프롤린 고밀도 영역은 6개의 추정상의 글리코실화 부위를 포함하는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 121.
제 119 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 서열번호 1 또는 48에 기재된 것이거나 이의 활성 부분인 것이 특
징인 분리된 핵산.
청구항 122.
제 119 항에 있어서, 폴리펩타이드는 서열번호 5에 기재된 것 또는 이의 활성 부분인 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 123.
제 119 항에 있어서, 폴리뉴클레오타이드 서열은 게놈 폴리뉴클레오타이드 서열, 상보성 폴리뉴클레오타이드 서열
및 합성 폴리뉴클레오타이드 서열로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인 분리된 핵산.
청구항 124.
제 119 항에 있어서, 프롤린 고밀도 영역이 서열번호 49에 기재된 것인 분리된 핵산.
청구항 125.
제 119 항에 기재된 분리된 핵산을 포함하는 핵산 작제물.
청구항 126.
제 125 항에 기재된 핵산 작제물을 포함하는 숙주 세포.
도면
도면1
공개특허 10-2004-0101889
- 45 -
도면2a
도면2b
도면3
도면4a
공개특허 10-2004-0101889
- 46 -
도면4b
도면5
공개특허 10-2004-0101889
- 47 -
도면6
공개특허 10-2004-0101889
- 48 -
도면7
도면8
공개특허 10-2004-0101889
- 49 -
도면9
도면10a
도면10b
도면10c
공개특허 10-2004-0101889
- 50 -
도면11
공개특허 10-2004-0101889
- 51 -
도면12a
공개특허 10-2004-0101889
- 52 -
도면12
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- 53 -
도면13
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- 54 -
도면14
공개특허 10-2004-0101889
- 55 -
도면15
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- 56 -
도면16a
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- 57 -
도면16b
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- 58 -
도면17
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- 59 -
도면18
공개특허 10-2004-0101889
- 60 -
도면19
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- 61 -
도면20
도면21
공개특허 10-2004-0101889
- 62 -
도면22
도면23
공개특허 10-2004-0101889
- 63 -
도면24
공개특허 10-2004-0101889
- 64 -
도면25
도면26a
공개특허 10-2004-0101889
- 65 -
도면26b
도면27a
도면27b
SEQUENCE LISTING
<110> Ramot At Tel Aviv University Ltd.
<120> CHITINASES, DERIVED FROM CARNIVOROUS PLANTS POLYNUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING THEREOF, AND METHOD
S OF
<130> P03088
<150> US 60/261,834
<151> 2001-01-17
공개특허 10-2004-0101889
- 66 -
<160> 49
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 1572
<212> DNA
<213> Nepenthes kassiana
<400> 1
atgaatgctc cgtgcttctg cttccatgca caaaaaatgc gaaaccacaa gcacagtacc 60
atgaggggtt gggtagtgct tctgctgctc aatttacctt tcctttcagc attccaatgc 120
ggccaacaag ccggtggagc gctgtgccac agtggactct gctgcagcca gtggggttgg 180
tgtggtacca cgagtgacta ctgcggaaat ggatgccaga gccagtgtgg tggcactgct 240
accactccgc cgccatctcc tccttctcca ccaccgccag ccactccttc ccctccgtcc 300
ccgccttctc ctgttggtgg agatgttagc tctatcatta cccgagaaat ctttgaagag 360
atgctcctgc atcgaaataa cgccgcttgc cctgcccgcg gattctacac ctacgaggca 420
ttcatcaccg ccgctcgctt cttcagcggc tttggcacca ctggtgattt caatacccgc 480
aagagagaac tagcagcttt cttgggccag acctcccatg aaaccaccgg ttagttcatg 540
ctcaccgaca agaaaataag gggcgattat atggcatgca ccaacttatc aaatttgact 600
ttagcagaag taccaatgag tgttgaaaca acttagtggt gattatatgg atgaaatgtt 660
ttattttaaa attgtttgat tccgaaaatt ctacatagga acaagactta tatacagtag 720
aataatattt ttgatttgaa atgatgtttt attagaaata aaatgaaaat gcgtaggagg 780
gtgggccacc gcacccgacg gtccatatgc atggggatac tgtttcaagg aggaggtcgg 840
ccagcctggt tcttattgtg ttccctctac acagtggcca tgcgccgctg gtaaaagtta 900
ctatggtcgg ggacccattc agctatccta gtaagtctca ttctcttttt cttattgttg 960
attaattatt aatattgaaa acgtaaaaca ttctcttttt cttattgttg attaattatt 1020
aatattgaaa acgtaaaaaa taaacccaaa ataaaagaat aaaaaataag gatcagtttt 1080
aatttttctt aacatcaaat tttttgaaaa ataaatttaa aattagagta aaaaaattga 1140
aattgaaggt agtcttaata ttttttaact gcgggctg
aactacaact acgggccgtc cggtcaagcc atcggacagc cgctactgga gaatccagat 1260
ttggtagccg gcgacgtgat cgtatcattc gaaacggcta tatggttctg gatgacgccg 1320
cagtacgaca agccgtcgtg ccatgacgta atgatcggaa aatggactcc gtcagctcct 1380
gacattgcag ccgggaggtt cccaggttac ggcgtgacga cgaacataat caacgggggg 1440
ctcgagtgtg ggagaggccc tgatgcgagg gtggctagtc gtattgggtt ctacgagagg 1500
tactgcgaca ttcttggcgt cgactacgga gataacttgg actgctacac ccagtggcca 1560
tttggtggat ga 1572
공개특허 10-2004-0101889
- 67 -
<210> 2
<211> 1673
<212> DNA
<213> Nepenthes kassiana
<400> 2
atggagatag catcagcaaa aatattcttt ggtttatccc tcttgggact actagcgctg 60
ggatcagcgg aacaatgcgg gagtcaagct gggggagccg tgtgtccagg gggcctgtgc 120
tgcagccaat atggctggtg tggcaccacc gacgactact gcggcgccgg atgccagagc 180
cagtgcagct ccagcggtgg cgaccccagc agccttgtta ctagagacaa gttcaatcag 240
atgctcaagc accggaatga tggcggctgc cccgctaaag gcttctacac ctacgatgct 300
ttcatagctg ccgcaaagtc cttccccgct tttgcagcca ccggcgacgc cgccacccgc 360
aaaagggaaa tcgccgcctt cctcgcccaa acttcccatg aaactaccgg ttagttcatc 420
ccttttagta tcccctgttt cttgttgttc aatctccgct accagtaata ctccatcaag 480
ttcactagat gtattagtac acacagtaac tttaattaag tttgtaatca tcgattcgaa 540
tatcttttaa gtcgtttttt taactgcact gctgtgtacg ggctgtgaaa atcttatgta 600
aatttgtagg gaaattgacg atttaagtat aaatatgagt ttgttatatt tggccagggg 660
gttgggcaag cgcaccagat ggaccgtatg cgtggggata ttgctatctc agggagcaag 720
gcaaccctgg atcttactgc gttcagagtg cccagtggcc gtgtgtcgcc ggcaagaaat 780
actacggtcg cggtcccatc cagatttcct agtaagcttt cgcatagcaa actttttatt 840
taaccacaaa tcctacgtga tgaagcgtta ccggtagtat ttatttttat ttttattttg 900
ttaatcctac tattttttat tataaaatac taggtaaaaa taaattatat ctgaaaatat 960
tgctgaaaat gactaacctg tgagttctgt ctactatcag actaattgag atgctttatt 1020
agtccccacg tcctaaagct taccttgtcg ctgcacccca ttacaaattt agcaatcctc 1080
ggcaccaacc caaccccggc ggctgggtta aatattactt tgtcgctaca cccccggcca 1140
aactttaaca accatcagtc gcttctcata ttttattccc ttcgacgatc atatagccta 1200
taaacatgtt accttaaaat catgtcctac acacagcaca tcacgtaacg taatgttaaa 1260
ctcgtgcttt tgttatcagc aacttcaact acggagcagc ggggaaagct ataggggtgg 1320
accttctaaa caacccggat ctggtcgaga aagaccctgt cgtttcgttc aagaccgcaa 1380
tctggttctg gatgacgccc cagtctccca agccctcgtg ccatgaagtc atcaccgggc 1440
ggtggacgcc ctcggcagcc gacaaatcgg ccgggagggt gcctggattc ggtgtggtca 1500
caaacatcat caacggtggg gtcgaatgcg gccatggaca agatgccaga gtggccgaca 1560
gaattggatt ctacaagcgg tactgtgata tacttggagt cggctatggc aacaatttgg 1620
actgctacaa tcagaggcct ttcggtaatg ggcttttgtg ggccaccgag tag 1673
<210> 3
공개특허 10-2004-0101889
- 68 -
<211> 954
<212> DNA
<213> Nepenthes kassiana
<400> 3
atggagatag catcagcaaa aatattcttt ggtttatccc tgttgggagt actagcgctg 60
ggatcagcgg aacaatgcgg gagtcaagct gggggagccg cgtgtccagg gggcctgtgc 120
tgcagccaat ttggctggtg tggcaccacc gacgactatt gcgaagccgg atgccagagc 180
cagtgcagct ccagcggtgg cgaccccagc agccttgtta ctagagacaa gttcaatcag 240
atgctcaagc accggaatga tggcggctgc cccgctaaag gcttctacac ctacgatgct 300
ttcatagctg ccgcaaagtc cttccccgct tttgcagcca ccggcgacgc cgccacccgc 360
aaaagggaaa tcgccgcctt cctcgcccaa acttcccatg aaactaccgg gggttgggca 420
agcgcaccag atggaccgta tgcgtgggga tattgctatc tcagggagca aggcaaccct 480
ggatcttact gcgttcagag tgcccagtgg ccgtgtgtcg ccggcaagaa atactacggt 540
cgcggtccca tccagatttc ctacaacttc aactacggag cagcggggaa agctataggg 600
gtggaccttc taaacaaccc ggatctggtc gagaaagacc ctgtcgtttc gttcaagacc 660
gcaatctggt tctggatgac gccccagtct cccaagccct cgtgccatga agtcatcacc 720
gggcggtgga cgccctcggc agccgacaaa tcggccggga gggtgcctgg attcggtgtg 780
gtcacaaaca tcatcaacgg tggggtcgaa tgcggccatg gacaagatgc cagagtggcc 840
gacagaattg gattctacaa gcggtactgt gatatacttg gagtcggcta tggcaacaat 900
ttggactgct acaatcagag gcctttcggt aatgggcttt tgtgggccac cgag 954
<210> 4
<211> 954
<212> DNA
<213> Nepenthes kassiana
<400> 4
atggagatag catcagcaaa aatattcttt ggtttatccc tcttgggact actagcgctg 60
ggatcagcgg aacaatgcgg gagtcaagct gggggagccg tgtgtccagg gggcctgtgc 120
tgcagccaat atggctggtg tggcaccacc gacgactact gcggcgccgg atgccagagc 180
cagtgcagct tcagcggtgg cgaccccagc agccttgtta ctagagacaa gttcaatcag 240
atgctcaagc accggaatga tggcggctgc cctgctaaag gcttctacac ctacgatgct 300
ttcatagctg ccgcaaagtc cttccccgct tttgcagcca ccggcgacgc cgccactcgc 360
aaaagggaaa tcgccgcttt cctcgcccaa acttcccatg aaactaccgg gggttgggca 420
agcgcaccag atggaccgta tgcgtgggga tattgctatc tgagggagca aggcaaccct 480
ggatcttact gcgttcagag tgcccagtgg ccgtgtgttg ccggcaagaa atactatggt 540
공개특허 10-2004-0101889
- 69 -
cgcggtccca tccagatttc ctacaacttc aactacggag cagcagggaa agctattggg 600
gtggaccttc taaacaaccc ggatctggtc gagaaagacc ctgtcgtttc gttcaagacc 660
gcaatttggt tctggatgac gccccagtct cccaagccct cgtgccatgc agtcatcacc 720
gggcggtgga cgccctcggc agccgacaaa tcagccggga gggtgcctgg attcggtgtg 780
gtcacaaaca tcatcaacgg tggggtcgaa tgcggccatg gacaagatgc cagagtggcc 840
gacagaattg gattctacaa gcggtactgt gatatacttg gagtcggcta tggcaacaat 900
ttggactgct acaatcagag gcctttcggt aatgggcttt tgtgggccac cgag 954
<210> 5
<211> 351
<212> PRT
<213> Nepenthes kassiana
<400> 5
Met Asn Ala Pro Cys Phe Cys Phe His Ala Gln Lys Met Arg Asn His
1 5 10 15
Lys His Ser Thr Met Arg Gly Trp Val Val Leu Leu Leu Leu Asn Leu
20 25 30
Pro Phe Leu Ser Ala Phe Gln Cys Gly Gln Gln Ala Gly Gly Ala Leu
35 40 45
Cys His Ser Gly Leu Cys Cys Ser Gln Trp Gly Trp Cys Gly Thr Thr
50 55 60
Ser Asp Tyr Cys Gly Asn Gly Cys Gln Ser Gln Cys Gly Gly Thr Ala
65 70 75 80
Thr Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Pro Pro Ala Thr Pro
85 90 95
Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro Val Gly Gly Asp Val Ser Ser Ile
100 105 110
Ile Thr Arg Gru Ile Phe Glu Glu Met Leu Leu His Arg Asn Asn Ala
115 120 125
Ala Cys Pro Ala Arg Gly Phe Tyr Thr Tyr Glu Ala Phe Ile Thr Ala
130 135 140
Ala Arg Phe Phe Ser Gly Phe Gly Thr Thr Gly Asp Phe Asn Thr Arg
145 150 155 160
Lys Arg Glu Leu Ala Ala Phe Leu Gly Gln Thr Ser His Glu Thr Thr
165 170 175
공개특허 10-2004-0101889
- 70 -
Gly Gly Trp Ala Thr Ala Pro Asp Gly Pro Tyr Ala Trp Gly Tyr Cys
180 185 190
Phe Lys Glu Glu Val Gly Gln Pro Gly Ser Tyr Cys Val Pro Ser Thr
195 200 205
Gln Trp Pro Cys Ala Ala Gly Lys Ser Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile
210 215 220
Gln Leu Ser Tyr Asn Tyr Asn Tyr Gly Pro Ser Gly Gln Ala Ile Gly
225 230 235 240
Gln Pro Leu Leu Glu Asn Pro Asp Leu Val Ala Gly Asp Val Ile Val
245 250 255
Ser Phe Glu Thr Ala Ile Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Tyr Asp Lys
260 265 270
Pro Ser Cys His Asp Val Met Ile Gly Lys Trp Thr Pro Ser Ala Pro
275 280 285
Asp Ile Ala Ala Gly Arg Phe Pro Gly Tyr Gly Val Thr Thr Asn Ile
290 295 300
Ile Asn Gly Gly Leu Glu Cys Gly Arg Gly Pro Asp Ala Arg Val Ala
305 310 315 320
Ser Arg Ile Gly Phe Tyr Glu Arg Tyr Cys Asp Ile Leu Gly Val Asp
325 330 335
Tyr Gly Asp Asn Leu Asp Cys Tyr Thr Gln Trp Pro Phe Gly Gly
340 345 350
<210> 6
<211> 318
<212> PRT
<213> Nepenthes kassiana
<400> 6
Met Glu Ile Ala Ser Ala Lys Ile Phe Phe Gly Leu Ser Leu Leu Gly
1 5 10 15
Leu Leu Ala Leu Gly Ser Ala Glu Gln Cys Gly Ser Gln Ala Gly Gly
20 25 30
Ala Val Cys Pro Gly Gly Leu Cys Cys Ser Gln Tyr Gly Trp Cys Gly
35 40 45
Thr Thr Asp Asp Tyr Cys Gly Ala Gly Cys Gln Ser Gln Cys Ser Ser
공개특허 10-2004-0101889
- 71 -
50 55 60
Ser Gly Gly Asp Pro Ser Ser Leu Val Thr Arg Asp Lys Phe Asn Gln
65 70 75 80
Met Leu Lys His Arg Asn Asp Gly Gly Cys Pro Ala Lys Gly Phe Tyr
85 90 95
Thr Tyr Asp Ala Phe Ile Ala Ala Ala Lys Ser Phe Pro Ala Phe Ala
100 105 110
Ala Thr Gly Asp Ala Ala Thr Arg Lys Arg Glu Ile la Ala Phe Leu
115 120 125
Ala Gln Thr Ser His Glu Thr Thr Gly Gly Trp Ala Ser Ala Pro Asp
130 135 140
Gly Pro Tyr Ala Trp Gly Tyr Cys Tyr Leu Arg Glu Gln Gly Asn Pro
145 150 155 160
Gly Ser Tyr Cys Val Gln Ser Ala Gln Trp Pro Cys Val Ala Gly Lys
165 170 175
Lys Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile Gln Ile Ser Tyr Asn Phe Asn Tyr
180 185 190
Gly Ala Ala Gly Lys Ala Ile Gly Val Asp Leu Leu Asn Asn Pro Asp
195 200 205
Leu Val Glu Lys Asp Pro Val Val Ser Phe Lys Thr Ala Ile Trp Phe
210 215 220
Trp Met Thr Pro Gln Ser Pro Lys Pro Ser Cys His Glu Val Ile Thr
225 230 235 240
Gly Arg Trp Thr Pro Ser Ala Ala Asp Lys Ser Ala Gly Arg Val Pro
245 250 255
Gly Phe Gly Val Val Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Val Glu Cys Gly
260 265 270
His Gly Gln Asp Ala Arg Val Ala Asp Arg Ile Gly Phe Tyr Lys Arg
275 280 285
Tyr Cys Asp Ile Leu Gly Val Gly Tyr Gly Asn Asn Leu Asp Cys Tyr
290 295 300
Asn Gln Arg Pro Phe Gly Asn Gly Leu Leu Trp Ala Thr Glu
305 310 315
<210> 7
공개특허 10-2004-0101889
- 72 -
<211> 132
<212> PRT
<213> Drosera capensis
<400> 7
Gly Gly Trp Pro Thr Ala Pro Asp Gly Pro Tyr Ala Trp Gly Tyr Cys
1 5 10 15
Phe Lys Gln Glu Gln Gly Asn Pro Gly Asp Tyr Cys Val Gln Ser Ser
20 25 30
Thr Tyr Pro Cys Ala Pro Gly Lys Lys Tyr Tyr Gly Arg Gly Pro Ile
35 40 45
Gln Ile Ser Asn Tyr Asn Tyr Gly Gln Cys Gly Ala Ala Ile Asn Gln
50 55 60
Pro Leu Leu Ser Asn Pro Asp Leu Val Ala Ser Asn Ala Asp Val Ser
65 70 75 80
Phe Glu Thr Ala Ile Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Gly Ser Lys Pro
85 90 95
Ser Cys His Ala Val Ala Thr Gly Gln Trp Thr Pro Ser Ala Ala Asp
100 105 110
Gln Ala Ala Gly Arg Val Pro Gly Tyr Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile
115 120 125
Asn Gly Gly Leu
130
<210> 8
<211> 78
<212> PRT
<213> Dionaea muscipula
<400> 8
Asn Cys Asn Tyr Gly Gln Cys Gly Glu Ser Ile Gly Gln Pro Leu Leu
1 5 10 15
Ala Asn Pro Asp Leu Val Ala Asn Asp Val Leu Ile Ser Phe Glu Thr
20 25 30
Ala Ile Trp Phe Trp Met Thr Pro Gln Trp Asn Lys Pro Ser Ser His
35 40 45
Asp Val Ile Thr Gly Asn Trp Ser Pro Ser Ser Ala Asp Gln Ala Ala
공개특허 10-2004-0101889
- 73 -
50 55 60
Gly Arg Leu Pro Gly Tyr Gly Val Ile Thr Asn Ile Ile Asn
65 70 75
<210> 9
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (11)..(11)
<223> Modified base: Inosine
<400> 9
gctgacaggg naaagaatct ttctatcac 29
<210> 10
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (9)..(9)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (23)..(23)
<223> Modified base: Inosine
<400> 10
공개특허 10-2004-0101889
- 74 -
gctgagatng ttagcnccag aancctctg 29
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (13)..(13)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Modified base: Inosine
<400> 11
ttnggncaag acntagcnca ctgagaac 28
<210> 12
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
공개특허 10-2004-0101889
- 75 -
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (8)..(8)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (15)..(15)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (18)..(18)
<223> Modified base: Inosine
<400> 12
gagtnccncc agttnatnat agtttacggt 30
<210> 13
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (5)..(5)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (16)..(16)
<223> Modified base: Inosine
<400> 13
ggggncaaga atcggnaatc gaaggg 26
<210> 14
<211> 28
<212> DNA
공개특허 10-2004-0101889
- 76 -
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<220>
<221> misc_feature
<222> (3)..(3)
<223> Modified base: Inosine
<220>
<221> misc_feature
<222> (6)..(6)
<223> Modified base: Inosine
<400> 14
canggnggag ttagttagta agaatctg 28
<210> 15
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 15
Cys Glu Gly Lys Asn Phe Tyr Thr
1 5
<210> 16
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 16
Gln Gly Phe Gly Ala Thr Thr Ile Arg
1 5
<210> 17
<211> 10
<212> PRT
공개특허 10-2004-0101889
- 77 -
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 17
Phe Leu Gly Ala Gln Thr Ser His Glu Thr
1 5 10
<210> 18
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 18
Thr Asn Ile Ile Asn Gly Gly Ile Leu
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 19
Trp Gly Gln Asn Gly Asn Glu Gly
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Recombinant partial sequence of chitinase gene product
<400> 20
Val Gln Phe Tyr Asn Asn Pro Pro Cys
1 5
<210> 21
공개특허 10-2004-0101889
- 78 -
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 21
gaaaatggac tccgtcagat cctgacattg c 31
<210> 22
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 22
gccccttatt ttcttgtcgg tgagcatgaa c 31
<210> 23
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 23
cgtttcgttc aagaccgcaa tctggttctg gatg 34
<210> 24
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 24
ctagtgaact tgatggagta ttactggtag cggag 35
<210> 25
<211> 34
<212> DNA
공개특허 10-2004-0101889
- 79 -
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 25
ctacaatcag aggcctttcg gtaatgggct tttg 34
<210> 26
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 26
catcattccg gtgcttgagc atctgattga acttg 35
<210> 27
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 27
cgacggtcca tatgcatggg gatactgttt caag 34
<210> 28
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 28
caaatggcca ctgggtgtag cagtccaagt tatc 34
<210> 29
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
공개특허 10-2004-0101889
- 80 -
<223> Single strand DNA primer
<400> 29
cgtggggata ttgctatctc ag 22
<210> 30
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 30
ctactcggtg gcccacaaaa 20
<210> 31
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 31
gtaaaactgg accagacgta gtc 23
<210> 32
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 32
cgggaatgaa ggaaccttca ac 22
<210> 33
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 33
공개특허 10-2004-0101889
- 81 -
gttgggtagt gcttctgctg ctc 23
<210> 34
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 34
catatcatca tccaccaaat ggccac 26
<210> 35
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 35
catcataacg aaaatggaga tagcatcag 29
<210> 36
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 36
cggttattgg gcctactcgg tg 22
<210> 37
<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 37
gaagcttcca tgaatgctcc gtgcttctgc ttc 33
<210> 38
공개특허 10-2004-0101889
- 82 -
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 38
gcaagcttgt ccaccaaatg gccactgggt g 31
<210> 39
<211> 36
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 39
gagatagcat cagcaaaaat attctttggt ttatcc 36
<210> 40
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 40
gcctcggtgg cccacaaaag cccattac 28
<210> 41
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial sequenc
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 41
gaaaatggac tccgtcagat cctgacattg c 31
<210> 42
<211> 31
<212> DNA
공개특허 10-2004-0101889
- 83 -
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 42
gccccttatt ttcttgtcgg tgagcatgaa c 31
<210> 43
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 43
cgtttcgttc aagaccgcaa tctggttctg gatg 34
<210> 44
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 44
ctagtgaact tgatggagta ttactggtag cggag 35
<210> 45
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
<223> Single strand DNA primer
<400> 45
ctacaatcag aggcctttcg gtaatgggct tttg 34
<210> 46
<211> 35
<212> DNA
<213> Artificial sequence
<220>
공개특허 10-2004-0101889
- 84 -
<223> Single strand DNA primer
<400> 46
catcattccg gtgcttgagc atctgattga acttg 35
<210> 47
<211> 37
<212> PRT
<213> Nepenthes kassiana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(37)
<223> Ch1 partial sequence: signal peptide
<400> 47
Met Asn Ala Pro Cys Phe Cys Phe His Ala Gln Lys Met Arg Asn His
1 5 10 15
Lys His Ser Thr Met Arg Gly Trp Val Val Leu Leu Leu Leu Asn Leu
20 25 30
Pro Phe Leu Ser Ala
35
<210> 48
<211> 1717
<212> DNA
<213> Nepenthes kassiana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1189)..(1189)
<223> Any nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1293)..(1293)
<223> Any nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1309)..(1309)
<223> Any nucleotide
공개특허 10-2004-0101889
- 85 -
<220>
<221> misc_feature
<222> (1317)..(1317)
<223> Any nucleotide
<220>
<221> misc_feature
<222> (1324)..(1324)
<223> Any nucleotide
<400> 48
atgaatgctc cgtgcttctg cttccatgca caaaaaatgc gaaaccacaa gcacagtacc 60
atgaggggtt gggtagtgct tctgctgctc aatttacctt tcctttcagc attccaatgc 120
ggccaacaag ccggtggagc gctgtgccac agtggactct gctgcagcca gtggggttgg 180
tgtggtacca cgagtgacta ctgcggaaat ggatgccaga gccagtgtgg tggcactgct 240
accactccgc cgccatctcc tccttctcca ccaccgccag ccactccttc ccctccgtcc 300
ccgccttctc ctgttggtgg agatgttagc tctatcatta cccgagaaat ctttgaagag 360
atgctcctgc atcgaaataa cgccgcttgc cctgcccgcg gattctacac ctacgaggca 420
ttcatcaccg ccgctcgctt cttcagcggc tttggcacca ctggtgattt caatacccgc 480
aagagagaac tagcagcttt cttgggccag acctcccatg aaaccaccgg ttagttcatg 540
ctcaccgaca agaaaataag gggcaccatg acgtaaatcc acacagcaac cgtataatgc 600
cgtataataa ctatcggatc attattcaat gtcatatgct aattctttta ttttaattaa 660
aaaaatattt ttaattagtt ttttaataac aaaaaatagt ggtattggat aataattcta 720
tgacaaccgt atgtacttat acggatgtca tacaaatctg catcgcagcg ttcctgtttt 780
acactgatat gcaccaactt accaaatttg actttaacag aagtacaaat gactgttgac 840
actacatagt atattttatt ttaaaattgt ttgattctga aaattctaca taggaacaag 900
aattatatta agtagaacaa tatttttgat ttgaaatgat gttttattag aaattaaatg 960
aaaatgcgta ggagggtggg ccaccgcacc cgacggtcca tatgcatggg gatactgttt 1020
caaggaggag gtcggccagc ctggttctta ttgtgttccc tctacacagt ggccatgcgc 1080
cgctggtaaa agttactatg gtcgaggacc cattcagcta tcctagtaag tctcattcac 1140
ttttccttat tgttgaataa ttattaatat cgaaaacgcg aaaaataanc ccaaaataaa 1200
agaataaaaa atagggatca attttaattt ttcttaacaa caaatttttt gaaaaataaa 1260
tttaaaatta aagtaaaaaa attgaaattg aanatagttt taatatttnt taactgnggg 1320
ctgnttggta tttgactttg aaagcaacta caactacggg ccgtccggtc aagccatcgg 1380
acagccgcta ctggagaatc cagatttggt agccggcgac gtg tcgtat cattcgaaac 1440
ggctatatgg ttctggatga cgccgcagta cgacaagccg tcgtgccatg acgtaatgat 1500
공개특허 10-2004-0101889
- 86 -
cggaaaatgg actccgtcag ctcctgacat tgcagccggg aggttcccag gttacggcgt 1560
gacgacgaac ataatcaacg gggggctcga gtgtgggaga ggccctgatg cgagggtggc 1620
tagtcgtatt gggttctacg agaggtactg cgacattctt ggcgtcgact acggagataa 1680
cttggactgc tacacccagt ggccatttgg tggatga 1717
<210> 49
<211> 28
<212> PRT
<213> Nepenthes kassiana
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(28)
<223> Ch1 partial sequence: Proline rich domain
<400> 49
Gly Gly Thr Ala Thr Thr Pro Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Pro
1 5 10 15
Pro Ala Thr Pro Ser Pro Pro Ser Pro Pro Ser Pro
20 25
식충성 식물 유래의 키티나제, 이를 암호화하는폴리뉴클레오타이드 서열 및 이의 분리방법 및 사용방법(CHITINASES, DERIVED FROM CARNIVOROUS PLANTSPOLYNUCLEOTIDE SEQUENCES ENCODING THEREOF, AND METHODSOF ISOLATING AND ..
2018. 1. 30. 15:11